Summary
Cuantitativo, de alto rendimiento, en tiempo real, y sin etiquetas de detección biomolecular (ADN, proteínas, etc) sobre SiO
Abstract
La medición sensible de interacciones biomoleculares tiene su uso en muchos campos y las industrias básicas como la biología y la microbiología, la vigilancia del medio ambiente / agrícola / biodefensa, la nanobiotecnología, y mucho más. Para aplicaciones de diagnóstico, la vigilancia (detección) la presencia, ausencia, o la expresión anormal de biomarcadores proteómicos humanos o dirigidos genómico en las muestras del paciente se puede utilizar para determinar los métodos de tratamiento o eficacia de la terapia. En el campo de la investigación, la información sobre las afinidades moleculares y las características específicas son útiles para caracterizar completamente el sistema bajo investigación.
Muchos de los sistemas actuales utilizados para determinar las concentraciones moleculares o las afinidades se basan en el uso de etiquetas. Ejemplos de estos sistemas incluyen inmunoensayos, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los ensayos de electroforesis en gel y espectrometría de masas (MS). Por lo general, estas etiquetas son fluorescentes, radiológicos o colorimétrica en la naturaleza y están directa o indirectamente conectado a la diana molecular de interés. Aunque el uso de etiquetas es ampliamente aceptado y tiene algunas ventajas, también hay desventajas que están estimulando el desarrollo de nuevas etiquetas sin métodos de medición de estas interacciones. Estas desventajas incluyen aspectos prácticos tales como el costo del ensayo mayor, el reactivo de la vida útil y facilidad de uso se refiere, el almacenamiento y la seguridad, la pérdida de tiempo y esfuerzo en el etiquetado, y la variabilidad entre los distintos reactivos, debido a los procesos de etiquetado o de las etiquetas de sí mismos. Sobre una base de investigación científica, el uso de estas etiquetas también pueden introducir dificultades en lo que respecta a los efectos sobre la funcionalidad de la proteína / estructura debido a la presencia de las etiquetas adheridas y la imposibilidad de medir directamente la interacción en tiempo real.
Que aquí se presenta es el uso de una nueva etiqueta sin biosensor óptico que puede ser objeto de estudios de microarrays, denominado sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS), para la detección de proteínas, ADN, material antigénico, patógenos enteros (viriones) y otros materiales biológicos. El sistema IRIS se ha demostrado que tienen una alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad de las interacciones biomoleculares diferentes [1-3]. Los beneficios incluyen la capacidad múltiple de imágenes en tiempo real y capacidades de punto final de medición, y otras de alto rendimiento de atributos tales como el consumo de reactivos reducida y una reducción en los tiempos de ensayo. Además, la plataforma IRIS es fácil de usar, requiere un equipo de bajo costo, y utiliza componentes basados en silicio sólido ensayo de fase por lo que es compatible con muchos enfoques contemporáneos de la superficie de la química.
A continuación, presentamos el uso del sistema IRIS, desde la preparación de las matrices de la sonda de la incubación y la medición del objetivo vinculante para el análisis de los resultados en un formato de punto final. El modelo de sistema será la captura de anticuerpos de destino que son específicos para la albúmina sérica humana (HSA) en la HSA con manchas sustratos.
Protocol
1. Preparación del soporte
- Escudo de capas de silicio SiO2 sustratos con auto-adsorción copoli (DMA-NAS-MAPS):
- La síntesis de copolímero, estructura química, y el proceso de recubrimiento se publican en: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caracterización de un recubrimiento polimérico adsorbida para las diapositivas de cristal de ADN Microarray. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358.
- En pocas palabras, preparar una solución de polímero mediante la adición de 100 mg de polímero a 5 ml de agua desionizada (DI) y añadir 5 ml de sulfato de amonio 40% de grasa saturada ((NH 4) 2SO 4) solución para llegar a una concentración final de 0,92 M.
- Chips de sumergirse en la solución durante 30 minutos en un agitador y luego enjuague bien con agua destilada. Secar bien con argón / N 2 gas.
- Chips de hornear a 80 º C durante 15 min.
- Tienda recubiertos con polímeros sustratos / chips en un ambiente seco (desecador de vacío) para un máximo de 3 meses hasta que la sonda manchado procedimiento.
2. Preparación de la matriz de la sonda: anticuerpos, antígenos, ss / dsDNA, RNA, etc
- Diluir la sonda (s) a la concentración adecuada en el buffer deseado. Este paso puede variar considerablemente, pero un experimento típico utiliza antígeno o de IgG en una concentración de 0,5 mg / ml (rango de 0.1-1 mg / ml) en tampón fosfato salino (PBS) a pH ≈ 7,4.
- Soluciones a cabo en un 96 - o 384 y placa (o la placa de la fuente estándar para el observador que se utiliza)
- Configuración de los parámetros de localización para la matriz de impresión deseada: determinar los parámetros apropiados para la detección de la superficie y las soluciones que se utilizan (tiempos de espera, las velocidades de aproximación, etc.) Determinar el número de réplicas de cada condición por la red, el diseño de cuadrícula, el número de redes de replicar, y la ubicación que desee detectar en el chip. Sustratos lugar y la placa de la fuente en los lugares apropiados, compruebe que las botellas de residuos y el suministro está listo, y comenzar a ejecutar la impresión.
- Después de ver terminado sustratos a cabo en un ambiente de alta humedad durante la noche (18.04 horas) para permitir que el proceso de inmovilización y la desactivación de proceder.
- Lavado de sustratos: colocarlos en las siguientes soluciones para tres minutos para tres lavados por separado: PBS con 0,1% de Tween (PBST), PBS, y finalmente el agua desionizada (DI). Dependiendo del tipo de experimento (húmedo vs seco), seca el chip completamente con gas Argón y comenzar la incubación o el lugar en el chip de una cámara de flujo y de montar.
- Desactivar restantes grupos NHS en la superficie de copolímero al sumergir las fichas en una solución 50 mM de etanolamina con el pH ajustado a 7,4 durante 30 minutos mientras que en un agitador de placas. Una amina primaria compuesto que contiene como hidroxilamina o Tris también se puede utilizar, siempre la solución preparada es seguro de usar con las proteínas. Enjuague bien la solución de desactivación con PBS entonces el agua DI.
- Paso opcional (dependiendo de la química de la superficie que se emplea): superficie del bloque con una solución de BSA, la caseína o leche rehidratada por 30 minutos. Para la química de la superficie actual de polímeros que utilizamos, no realice este paso como el esqueleto del polímero actúa para evitar la unión no específica de proteínas.
3. Adquisición de Datos e Incubación de procedimiento: formato de punto final
- Prepare una solución de la meta de interés en el buffer deseado. En este caso, será una solución de la concentración adecuada de anti-BSA en PBS (por ejemplo: hacer 1-10 ml de un 10 ng / ml de solución de anti-BSA en PBS). Además, asegúrese de disponer de una cantidad equivalente de tampón (sin objetivo) para la incubación de control negativo.
- Disfrutar de un escaneo espejo de silicio para la normalización de todos los datos recogidos posteriormente.
- Busque en la serie de la sonda preparada con el sistema IRIS antes de la etapa de incubación para determinar la altura inicial de óptica (masa) en cada punto. Esto permitirá un análisis adecuado de los cambios en la masa en la superficie, es decir, el nivel de unión, después de la incubación. Aquí, algunos parámetros se ajustan para el experimento actual, tales como el tiempo de exposición, el campo de visión, centrándose prosperando, etc
- Sumerja chip (s) de solución preparada para 1 hora en un agitador de placas. El tiempo de incubación puede variar considerablemente en función del nivel de agitación, la concentración de la meta de ser detectado, las características del transporte de la cámara de flujo (si es un modo de detección en tiempo real se está utilizando), las afinidades de la pareja de objetivos de la sonda, etc .
- Después de la incubación, repita el procedimiento de lavado descrito en el paso 2.5)
- Exploración de la matriz misma sonda con el sistema IRIS y obtener imágenes post-incubación para la comparación de pre-incubación.
- Repita este proceso para diferentes etapas de incubación, si es necesario, por ejemplo, en un formato de ensayo de tipo sándwich donde se utiliza un anticuerpo secundario.
4. Análisis de Datos
- Ajustar las imágenes recogidas para cada escaneo del iris (la secuencia de imágenes de intensidad), utilizando el software de laboratorio desarrollado para proproducir una imagen de la matriz que contiene la información de la sonda espesor óptico. Un rápido análisis cualitativo de la unión puede realizarse restando (registrada) post-y pre-incubación de las imágenes. Vinculante aparecerá como un cambio en la intensidad en esos puntos donde los cambios se observaron en masa. Para el análisis cuantitativo, determinar la densidad de la masa de cada punto en comparación con el fondo de un promedio de espesor óptico de la información para cada píxel en un lugar y un anillo exterior de la mancha y hacer una comparación directa de estas dos áreas.
5. Los resultados representativos:
La figura 1 muestra un esquema ejemplo de la capa de Si-SiO 2 sustrato IRIS visto con una amplia representación de anticuerpos. Cada conjunto de anticuerpos se detecta en replicar con la especificidad de un epítopo diferente orientación proteínas diferentes. Dos virus diferentes y toda una proteína viral se presentan como objetivos de ejemplo. Anticuerpos negativos de control dependen de la prueba y pueden ser no específicos y / o específicas de virus.
La figura 2 muestra la unión de la albúmina sérica humana (HSA) de anticuerpos específicos para una serie de manchas HSA y el conejo puntos IgG (control). Como se ve aquí, después del montaje y la determinación del espesor óptico de las imágenes pre y post incubación, una imagen de diferencia de la matriz de unión se pueden crear para evaluar cualitativamente vinculante. El análisis cuantitativo revela que un 2,05 y 0,13 nanómetros significa cambiar la altura de óptica se observó para la HSA y los puntos de IgG de conejo, respectivamente, para una concentración de incubación anti-HSA de 500 ng / mL.
La Figura 3 muestra una medición de la dependencia IRIS piel de unión a proteínas en la concentración de proteínas y la longitud de ADN de doble cadena de oligómeros. El gráfico superior muestra las mediciones de altura absoluta óptica para inicial inmovilizado alturas oligómero de la sonda y post-incubación, encuadernación de piel. Aumento de las concentraciones de la piel (50, 100, 200 nM) dio lugar a un aumento de unión a las sondas de ADN. La longitud de los oligómeros también afecta unión con secuencias más largas de piel que resulta en un carácter más vinculante. En este caso, las barras de error representan una desviación estándar de la media. La trama parte inferior muestra dímero calcula proteína piel de enlace por cadena ADN de doble cadena. Dímero vinculante, fue significativamente superior a la concentración de proteínas de piel de 200 Nm que sugiere un alto nivel de la unión no específica.
Figura 1. Esquema de una matriz sonda ejemplo normalmente utilizado en un experimento para detectar virus específicos y componentes virales en forma multiplexada con el sistema IRIS.
Figura 2. Post-incubación imagen de diferencia para la unión de la albúmina sérica humana de anticuerpos específicos para HSA visto recogidos con este sistema sin etiqueta en una concentración de 500 ng / mL. La densidad de masa biomaterial para cada punto se determina por un promedio de espesor óptico de la información en un lugar y luego compararlo con el promedio de un anillo alrededor de la mancha que representa el fondo.
Figura 3. Parcela de enlace de datos para las interacciones proteína piel con manchas de doble cadena oligómeros con una secuencia de consenso conocidos basados en la duración de oligómeros, la ubicación de la secuencia de consenso dentro del oligómero, y la concentración de la proteína Fur. Información acerca de la cantidad absoluta de la proteína de piel atado a cada secuencia visto (arriba) se puede utilizar para estimar el número de dímeros de piel atado a cada tipo de oligómero (abajo).
Discussion
La plataforma IRIS es un sistema rápido y sencillo de utilizar para la recogida de alto rendimiento del enlace de datos en un formato de microarrays. Al inmovilizar covalentemente diferentes sondas de ADN o la proteína funcional en una superficie, los antígenos diana / biomarcadores / etc. puede ser capturado de la solución, como en un inmunoensayo. La medición de estas interacciones a través de las condiciones de la sonda en un extremo o el formato en tiempo real con el sistema IRIS permite que la información altamente sensible y cuantitativo que deben recopilarse para cada interacción. El experimento representativo detallada aquí es sólo un ejemplo de los tipos de interacciones que pueden ser estudiados con esta técnica. La detección de factores de transcripción, los antígenos virales y virus completos se ha demostrado previamente, y representa sólo algunos ejemplos de los tipos de análisis que el IRIS puede manejar fácilmente.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Zoiray Technologies Inc., un socio co-patrocinador y la comercialización, por su apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
- Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
