Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

Summary

Detecção biomolecular quantitativos, de alto rendimento, em tempo real, sem rótulo e (DNA, proteínas, etc) em SiO

Abstract

A medição sensíveis de interações biomoleculares tem uso em muitos campos e indústrias como a biologia básica e microbiologia, monitoramento ambiental / agrícola / biodefesa, nanobiotecnologia, e muito mais. Para aplicações de diagnóstico, monitoramento (detectar) a presença, ausência, ou a expressão anormal de biomarcadores de proteômica alvo ou genômico encontrado em amostras de pacientes pode ser usado para determinar abordagens de tratamento ou eficácia terapêutica. Na área da pesquisa, a informação sobre afinidades e especificidades molecular são úteis para a plena caracterização dos sistemas sob investigação.

Muitos dos sistemas atuais empregados para determinar as concentrações moleculares ou afinidades contam com o uso de etiquetas. Exemplos desses sistemas incluem imunoensaios tais como o ensaio imunoenzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase (PCR), ensaios de eletroforese em gel e espectrometria de massa (MS). Geralmente, esses rótulos são fluorescentes, radiológicas, ou colorimétrico na natureza e estão directa ou indirectamente ligados ao alvo molecular de interesse. Embora o uso de etiquetas é amplamente aceito e tem algumas vantagens, há desvantagens que estão estimulando o desenvolvimento de novas rótulo sem métodos para medir essas interações. Estas desvantagens incluem aspectos práticos, tais como o custo aumentou ensaio, reagentes vida e as preocupações de armazenamento, usabilidade e segurança, desperdício de tempo e esforço na rotulagem, ea variabilidade entre os reagentes diferentes devido aos processos de rotulagem ou rótulos próprios. Em uma base de pesquisa científica, o uso desses rótulos também pode introduzir dificuldades, tais como preocupações com os efeitos sobre a funcionalidade de proteínas / estrutura devido à presença dos rótulos anexados ea incapacidade de medir diretamente as interações em tempo real.

Aqui apresentada é a utilização de um biosensor rótulo sem nova ótica que é passível de microarray estudos, denominado o Imaging Sensor Interferometric Reflectância (IRIS), para detecção de proteínas, DNA, material antigênico, patógenos todo (virions) e outro material biológico. O sistema IRIS tem sido demonstrado ter alta sensibilidade, precisão e reprodutibilidade de interações biomoleculares diferentes [1-3]. Benefícios incluem a capacidade multiplex de imagem, em tempo real e capacidades de medição endpoint, e outros de alto rendimento atributos, tais como consumo de reagente, bem como diminuição nos tempos de ensaio. Além disso, a plataforma IRIS é simples de usar, requer equipamento barato, e utiliza silício baseados em componentes do ensaio em fase sólida tornando-o compatível com muitas abordagens contemporâneas de química de superfície.

Aqui, apresentamos o uso do sistema IRIS, desde a preparação de matrizes de sonda para incubação e medição de meta vinculativa para a análise dos resultados em formato de ponto de extremidade. O sistema modelo será a captura de anticorpos alvo, que são específicas para albumina sérica humana (HSA), em HSA-spotted substratos.

Protocol

1. Preparação do substrato

1. Revestimento em camadas de silício SiO ₂ substratos com a auto-adsorção copoly (DMA-NAS-MAPS):
   1. Síntese de copolímero, estrutura química e processo de revestimento são publicados em: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caracterização de um revestimento polimérico adsorvido para lâminas de vidro DNA Microarray. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358.
   2. Brevemente, preparar solução de polímero por adição de 100 mg de polímero de 5 mL de água deionizada (DI) e adicionar 5 mL de sulfato de amônio 40% saturada ((NH ₄₎ 2SO ₄₎ solução para alcançar uma concentração final de 0,92 M.
   3. Chips de submergir em solução por 30 min em um agitador e enxague bem com água DI. Seque bem com Argon / N ₂ de gás.
   4. Fichas leve ao forno a 80 ° C por 15 min.
2. Loja de polímero revestido substratos / fichas em um ambiente seco (exsicador de vácuo) para até 3 meses até sonda spotting procedimento.

2. Preparação de Probe Array: Anticorpos antígenos, ss / dsDNA, RNA, etc

1. Diluir sonda (s) para concentração adequada em tampão desejado. Este passo pode ser muito variável, mas uma experiência típica utiliza antígeno ou IgG em uma concentração de 0,5 mg / mL (faixa de 0,1 -1 mg / mL) em tampão fosfato salino (PBS), pH ≈ 7,4.
2. Coloque soluções em um 96 - ou 384 bem-chapa (ou placa de fonte padrão para o observador a ser utilizado)
3. Configuração de parâmetros para spotting desejado série impresso: determinar os parâmetros adequados para manchar a superfície e as soluções a ser utilizado (tempos de parada, velocidades de aproximação, etc.) Determinar o número de repetições de cada condição por grade, o layout de grade, o número de grades de replicar, e no local desejado spotting no chip. Substratos lugar e placa de fonte nos locais apropriados, certifique-se garrafas de resíduos e abastecimento estão prontas, e começar a executar a impressão.
4. Depois de spotting é terminar substratos lugar em um ambiente de alta umidade durante a noite (4-18 horas) para permitir processo de imobilização e desativação para prosseguir.
5. Lavar substratos: colocá-los nas seguintes soluções durante três minutos para três lavagens separadas: PBS com Tween 0,1% (PBST), PBS e, finalmente, água deionizada (DI). Dependendo do tipo de experimento (wet vs seco), seca o chip completamente com gás argônio e começar a incubação ou colocar o chip em uma câmara de fluxo e montar.
6. Desativar demais grupos NHS na superfície copolímero submergindo as fichas em uma solução de 50 mM de etanolamina com o pH ajustado para 7,4 por 30 minutos, enquanto em uma placa de shaker. Um composto contendo aminas primárias, como hidroxilamina ou Tris também pode ser usado, desde a solução preparada é seguro para uso com proteínas. Lavar cuidadosamente a solução desativação usando PBS, em seguida, água DI.
7. Passo opcional (dependendo da química de superfície sendo empregados): Bloco de superfície usando uma solução de BSA, caseína, leite ou reidratado durante 30 minutos. Para a química da superfície de polímero atual que usamos, nós não realizar esta etapa como a espinha dorsal de polímeros para evitar que atos não-específica ligação às proteínas.

3. Dados Procedimento de Aquisição e Incubação: formato Endpoint

1. Faça uma solução do alvo de interesse no buffer desejado. Aqui, será uma solução de concentração adequada de Anti-BSA em PBS (ex: make mL 10/01 de uma ng 10 / mL de solução anti-BSA em PBS). Além disso, certifique-se de ter uma quantidade equivalente de tampão (sem destino) para a incubação de controle negativo.
2. Dê uma varredura espelho de silício para normalizar todos os dados recolhidos posteriormente.
3. Varredura da matriz sonda preparada com o sistema IRIS antes da etapa de incubação para determinar a altura inicial óptico (massa) em cada ponto. Isto irá permitir a análise adequada das alterações na massa na superfície, ou seja, o nível de vinculação, após a incubação. Aqui, alguns parâmetros serão ajustados para o experimento atual, como tempo de exposição, campo de visão, concentrando-se prosperando, etc
4. Chip de submergir (s) em solução preparada para uma hora em uma placa de shaker. O período de incubação pode variar consideravelmente, dependendo do nível de agitação, a concentração de alvo a ser detectado, as características de transporte da câmara de fluxo (se um modo de detecção em tempo real está sendo usado), as afinidades do par-alvo de sondagem, etc .
5. Após a incubação, repita o procedimento de lavagem descrito no passo 2.5)
6. Digitalização a matriz mesma sonda usando o sistema IRIS e obter pós-incubação imagens para pré-incubação de comparação.
7. Repita esse processo para as etapas de incubação diferente, se necessário, por exemplo, em um formato de ensaio sanduíche onde um anticorpo secundário está sendo usado.

4. Análise de Dados

1. Se encaixam as imagens coletadas para cada scan IRIS (seqüência de imagens de intensidade), utilizando o software desenvolvido para lab-produzir uma imagem da sonda a matriz contendo informações espessura óptica. Uma rápida análise qualitativa de ligação pode ser feita subtraindo (registrados) e pós-pré-incubação imagens. Ligação aparecerá como uma mudança na intensidade naqueles pontos onde as mudanças de massa foram observados. Para a análise quantitativa, determinar as densidades de massa de cada ponto em relação ao fundo pela média informações espessura óptica para cada pixel dentro de um local e um anel fora do local e fazer uma comparação direta entre estas duas áreas.

5. Resultados representativos:

A Figura 1 mostra um exemplo do esquema em camadas Si-SiO substrato IRIS ₂ manchado com uma matriz de anticorpos representante. Cada conjunto de anticorpos é visto em replicar com especificidade para um epítopo diferente direcionamento proteínas diferentes. Dois diferentes vírus inteiros e uma proteína viral são representados como alvos exemplo. Anticorpos controle negativo depende do ensaio e pode ser não-específica e / ou vírus específico.

A Figura 2 mostra a ligação de albumina sérica humana (HSA) com anticorpos monoclonais específicos para uma matriz de spotted HSA e IgG de coelho (controle) pontos. Como pode ser visto aqui, após a montagem e determinação da espessura óptica para as imagens pré e pós-incubação, uma imagem de diferença para a matriz de ligação pode ser criado para avaliar qualitativamente vinculativo. Análise quantitativa revela que um 2,05 e 0,13 nanômetros significa alterar a altura óptico foi observado para o HSA e spots de coelho IgG, respectivamente, para uma concentração de incubação anti-HSA de 500 ng / mL.

A Figura 3 mostra uma medida de dependência IRIS Fur ligação às proteínas sobre a concentração de proteína e comprimento oligômero dsDNA. O gráfico de cima mostra absoluta medidas de altura ópticos para alturas inicial oligômero imobilizado sonda e pós-incubação de ligação Fur. Concentrações crescentes de pele (50, 100, 200 nM) resultou na ligação aumentada para sondas de DNA. O comprimento dos oligômeros também impactos vinculativo Fur com seqüências mais longas, resultando em mais vinculativo. Aqui, barras de erro representam um desvio-padrão da média. O enredo inferior mostra dímero de proteínas calculado Fur ligação por fio dsDNA. Dimer ligação foi significativamente maior na concentração de proteína Fur de 200 nM sugerindo um alto nível de ligação não específica.

Figura 1. Esquemática de um array sonda exemplo, normalmente utilizado em um experimento para detectar vírus e componentes específicos viral de forma multiplexada com o sistema IRIS.

Figura 2. Pós-incubação imagem diferença para a ligação de albumina de soro humano de anticorpos específicos para manchado HSA coletados com este sistema de rótulo livre na concentração de 500 ng / mL. A densidade de massa biomaterial para cada ponto é determinado pela média de espessura óptica informações dentro de um local e depois comparar com a média de um anel em torno do ponto que representa o fundo.

Figura 3. Lote de ligação de dados para as interações Fur proteína com spotted double-stranded oligômeros com uma seqüência consenso conhecido com base no comprimento de oligômero, localização da seqüência de consenso no âmbito do oligômero, ea concentração de proteínas da pele. Informações sobre a quantidade absoluta de proteína Fur obrigado a cada seqüência manchado (em cima) pode ser usado para estimar o número de dímeros Fur vinculados a cada tipo de oligômero (baixo).

Discussion

A plataforma IRIS é um sistema simples e rápido de usar para a recolha de high-throughput de ligação de dados em um formato de microarray. Por imobilizar covalentemente diferentes sondas funcionais de proteínas ou DNA em uma superfície antígenos alvo / biomarcadores / etc. podem ser capturados a partir de solução, como em um imunoensaio. Medição dessas interações entre as condições sonda em um terminal ou em tempo real formato com o sistema IRIS permite que a informação altamente sensível e quantitativos a serem coletados para cada interação. O experimento representante detalhado aqui é apenas um exemplo dos tipos de interações que podem ser estudados com esta técnica. Detecção de fatores de transcrição, os antígenos virais, vírus e todo tem sido demonstrado anteriormente e representa apenas alguns exemplos dos tipos de análises que o IRIS pode facilmente manipular.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide	Silicon Valley Microelectronics
Ammonium sulfate powder	Sigma-Aldrich	A5132
Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate	Fisher Scientific	BP665-1
Antibody to human serum albumin (Anti-HSA)	Sigma-Aldrich	A0433
Human serum albumin (HSA)	Sigma-Aldrich	A9511
Argon or nitrogen gas (ultra-high purity)	Airgas	AR UHP300 or NI UHP300
Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	0875713A
Scienceware® vacuum desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-120
96-well plates, low cell binding	Nalge Nunc international	145399
BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer	Bio-Rad
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Hydroxylamine	Thermo Fisher Scientific, Inc.	26103
Multi-purpose rotator, model # 2314	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314Q
Retiga 2000R camera	QImaging	01-RET-2000R-F-M-12
AcuLED illumination source	PerkinElmer, Inc.
Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.)	Thorlabs Inc.