Summary
الكمية ، والإنتاجية العالية ، في الوقت الحقيقي ، والتسمية خالية من الكشف الجزيئية البيولوجية (DNA والبروتين ، الخ) على شافي
Abstract
قياس التفاعلات الجزيئية البيولوجية الحساسة واستخدامها في العديد من المجالات والصناعات الأساسية مثل البيولوجيا والميكروبيولوجيا ، والرصد البيئي / الزراعية / الدفاع البيولوجي ، النانوية ، وأكثر من ذلك. لتطبيقات التشخيص ، يمكن رصد (كشف) يمكن استخدام وجود ، الغياب ، أو تعبير غير عادي من المؤشرات الحيوية استهدفت البروتين الجيني أو وجدت في عينات من المرضى لتحديد أساليب علاجية أو نجاعة العلاج. بحث في الساحة ، ومعلومات عن الانتماءات الجزيئية وخصوصياتها مفيدة تماما لوصف الأنظمة قيد التحقيق.
كثير من النظم الحالية المستخدمة في تحديد تركيزات الجزيئية أو الانتماءات تعتمد على استخدام التسميات. أمثلة على هذه النظم تشمل المناعية مثل فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA) ، سلسلة تفاعل البلمرة (PCR) التقنيات والمقايسات الكهربائي للهلام ، ومطياف الكتلة (MS). عموما ، هذه التسميات هي الفلورسنت ، والإشعاعية ، أو اللونية في الطبيعة ، وبصورة مباشرة أو غير مباشرة تعلق على هدف الجزيئية للاهتمام. على الرغم من المقبول على نطاق واسع على استخدام التسميات وبعض الفوائد ، وهناك عيوب التي حفز تطوير أساليب تسمية جديدة خالية لقياس هذه التفاعلات. وتشمل هذه العوائق جوانب عملية مثل مقايسة التكاليف المتزايدة ، والمخاوف عمر الكاشف سهولة الاستخدام والتخزين والسلامة ، وإهدارا للوقت والجهد في وضع العلامات ، وتقلب بين الكواشف مختلفة بسبب عمليات وضع العلامات أو الملصقات نفسها. على أساس البحث العلمي ، ويمكن استخدام هذه التسميات أعرض أيضا صعوبات مثل الشواغل مع تأثيرات على وظيفة البروتين / هيكل بسبب وجود تسميات المرفقة وعدم القدرة على قياس التفاعلات مباشرة في الوقت الحقيقي.
يسمى التصوير الانعكاس التداخل الاستشعار (IRIS) المقدمة هنا هو استخدام جهاز الاستشعار البيولوجي تسمية جديدة خالية البصرية التي هي قابلة للميكروأري الدراسات ، على سبيل الكشف عن البروتينات والحمض النووي ، المادة مستضدي ، ومسببات الأمراض كله (virions) والمواد البيولوجية الأخرى. وقد أثبت نظام IRIS لحساسية عالية ، والدقة ، واستنساخ لالتفاعلات الجزيئية البيولوجية المختلفة [1-3]. وتشمل فوائد متعددة القدرات والتصوير ، والوقت الحقيقي ، وقياس قدرات نقطة النهاية ، وغيرها من الصفات الإنتاجية العالية مثل استهلاك كاشف مخفضة وتخفيض في أوقات الفحص. بالإضافة إلى ذلك ، IRIS منصة سهلة الاستعمال ، ويتطلب معدات مكلفة ، ويستخدم السيليكون القائم على فحص مكونات المرحلة الصلبة مما يجعلها متوافقة مع العديد من مناهج الكيمياء المعاصرة السطح.
هنا ، فإننا نقدم لاستخدام نظام IRIS من إعداد مصفوفات تحقيق لحضانة وقياس هدف ملزم لتحليل النتائج في شكل نقطة النهاية. وسوف يكون في النظام النموذجي القبض على الأجسام المضادة التي تستهدف محددة للألبومين المصل البشري (HSA) HSA - رصدت على ركائز.
Protocol
1. الركيزة التحضير
- معطف الطبقات السيليكون شافي 2 ركائز مع الذات التكثيف copoly (DMA - NAS - MAPS) :
- وتنشر التوليف كوبوليمر ، التركيب الكيميائي ، وعملية الطلاء في : G. Pirri ، F. Damin ، M. خياري ، E. Bontempi ، Depero جنيه. توصيف طلاء البوليمر كثف الشرائح الحمض النووي للزجاج ميكروأري. الشرج. الكيميائي. 2004 ، 76 ، 1352-1358.
- لفترة وجيزة ، وإعداد البوليمر الحل بإضافة 100 ملغ من البوليمر إلى 5 مل من الماء (DI) منزوع الأيونات وإضافة 5 مل من 40 ٪ كبريتات الامونيوم المشبع ((NH 4) 2SO 4) للوصول إلى الحل النهائي للتركيز 0.92 م.
- رقائق تغرق في حل لمدة 30 دقيقة على شاكر ، ثم تشطف جيدا بالماء DI. يجف تماما مع الأرجون / N غاز 2.
- رقائق خبز عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- مخزن البوليمر المغلفة ركائز / رقائق في بيئة جافة (فراغ مجفف) لمدة تصل إلى 3 أشهر حتى اكتشاف التحقيق الداخلي.
2. إعداد صفيف دقق : الأضداد ، مستضدات ، SS / dsDNA ، RNA ، الخ.
- تمييع التحقيق (ق) إلى التركيز المناسب في المخزن المؤقت المطلوب. يمكن أن تكون هذه الخطوة تختلف اختلافا كبيرا ، ولكن تجربة نموذجية تستخدم مستضد أو مفتش الحكومة بتركيز 0.5 ملغ / مل (تراوح من 0.1 -1 ملغ / مل) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) على الرقم الهيدروجيني ≈ 7.4.
- الحلول في المركز 96 -- 384 أو جيدا لوحة (لوحة أو معيار المصدر للاستخدام يتم نصاب)
- إعداد المعلمات لاكتشاف مجموعة طبعت المطلوب : تحديد المعايير المناسبة لتحديد موقع السطح والحلول المستخدمة (يسكن مرات ، وبسرعة النهج ، الخ). تحديد عدد يكرر كل حالة في الشبكة ، وتخطيط الشبكة ، وعدد النسخ المتماثل الشبكات ، والموقع المطلوب تحديد موقع على الرقاقة. مكان وركائز لوحة مصدر في المواقع المناسبة ، تحقق للتأكد من النفايات وتوريد زجاجات جاهزة ، وتبدأ تشغيل الطباعة.
- بعد الانتهاء من ركائز اكتشاف مكان في بيئة عالية الرطوبة بين عشية وضحاها (18/04 ساعة) للسماح الشلل والتعطيل عملية للمضي قدما.
- غسل ركائز : ضعها في الحلول التالية لمدة ثلاث دقائق لمدة ثلاث يغسل منفصلين : برنامج تلفزيوني مع توين 0.1 ٪ (PBST) ، برنامج تلفزيوني ، وأخيرا منزوع الأيونات الماء (DI). اعتمادا على نوع من التجربة (الرطب مقابل الجافة) وجافة تماما مع شرائح غاز الارجون وتبدأ الحضانة أو مكان الشريحة في غرفة التدفق والتجمع.
- تنشيط المجموعات المتبقية على سطح NHS كوبوليمر التي غمرت رقائق في محلول 50 ملم إيثانولامين مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 لمدة 30 دقيقة في حين على طبق من ذهب شاكر. ويمكن أيضا الأمينات الأولية التي تحتوي على مركب مثل هيدروكسيل تريس أو استخدامها ، ما دام الحل أعد آمن للاستخدام مع البروتينات. شطف جيدا الحل التعطيل باستخدام المياه PBS DI ذلك الحين.
- خطوة اختيارية (اعتمادا على السطح التي يجري استخدامها الكيمياء) : سطح كتلة باستخدام حل جيش صرب البوسنة ، الكازين ، أو الحليب ممهى لمدة 30 دقيقة. للكيمياء السطح البوليمرية الحالية التي نستخدمها ، ونحن لا تؤدي هذه الخطوة باعتبارها العمود الفقري لمنع أعمال البوليمر غير محددة وملزمة البروتين.
3. الحصول على البيانات والاحتضان الداخلي : شكل نقطة النهاية
- جعل إيجاد حل لهدف الفائدة المرجوة في المنطقة العازلة. هنا ، سوف يكون حلا مناسبا للتركيز على مكافحة جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني (مثلا : جعل مل من 10-10 نانوغرام / 10 مل من حل جيش صرب البوسنة في مكافحة PBS). أيضا ، تأكد من أن مبلغ يعادل العازلة (بدون هدف) لحضانة السيطرة السلبية.
- اتخاذ فحص المرآة السيليكون لتطبيع جميع البيانات التي يتم جمعها لاحقا.
- تفحص مجموعة التحقيق مع استعداد النظام IRIS قبل الحضانة خطوة لتحديد ارتفاع الأولي الضوئية (الشامل) في كل بقعة. هذا سوف يسمح لتحليل سليم للتغيرات في الكتلة على السطح ، أي مستوى ملزمة ، وبعد الحضانة. هنا ، سوف يتم تعديل عدد قليل من المعالم في التجربة الحالية ، مثل وقت التعرض ، ومجال الرؤية ، مع التركيز ازدهارا ، الخ.
- رقاقة يغرق (ق) في حل أعدت لمدة 1 ساعة على طبق من ذهب شاكر. فترة حضانة يمكن أن تختلف تبعا كبير على مستوى الإثارة ، ويجري الكشف عن التركيز على الهدف ، وخصائص النقل من الغرفة تدفق (إذا كان يتم استخدام طريقة الكشف في الوقت الحقيقي) ، والانتماءات من الزوج الهدف مسبار ، الخ .
- بعد الحضانة ، كرر الإجراء هو موضح في الخطوة غسل 2.5)
- تفحص مجموعة التحقيق نفسه باستخدام نظام آيريس والحصول على حضانة الصور بعد لمرحلة ما قبل الحضانة المقارنة.
- كرر هذه العملية للحصول على خطوات مختلفة الحضانة إذا لزم الأمر ، على سبيل المثال في شكل شطيرة الفحص حيث يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية.
4. تحليل البيانات
- تناسب كل الصور التي تم جمعها لفحص IRIS (تسلسل الصور كثافة) ، وذلك باستخدام البرمجيات المتقدمة إلى مختبر للمحترفينديوس صورة من مجموعة من المعلومات البصرية التي تحتوي على التحقيق سمك. يمكن إجراء تحليل سريع النوعي للملزمة بطرح (مسجلة) وآخر ما قبل الحضانة الصور. وسوف تبدو وكأنها ملزمة تغيير في كثافة في تلك الاماكن التي لوحظت تغييرات الشامل. للتحليل الكمي ، وتحديد كثافة كتلة كل بقعة مقارنة بمتوسط الخلفية بواسطة المعلومات البصرية سمك لكل بكسل في بقعة وخارج الحلقة من مكان الحادث وإجراء مقارنة مباشرة لهاتين المنطقتين.
5. ممثل النتائج :
الشكل 1 يبين المثال التخطيطي لطبقات سي شافي الركيزة IRIS 2 شوهد مع ممثل مجموعة الأضداد. ورصدت كل فرقة للأجسام المضادة في تكرار مع خصوصية لحاتمة مختلفة تستهدف بروتينات مختلفة. تمثل اثنين من فيروسات مختلفة تماما والبروتين الفيروسي كأهداف المثال. الأضداد السيطرة السلبية تعتمد على الفحص ويمكن أن تكون غير محددة و / أو فيروس معين.
ويبين الشكل 2 الملزمة للألبومين المصل البشري (HSA) محددة الأجسام المضادة لمجموعة هائل سعيد أنعم ورصدت والأرانب البقع مفتش (مراقبة). ينظر إليها على أنها هنا ، بعد تركيب وتصميم سمك البصرية للصور قبل وبعد الحضانة ، ويمكن خلق صورة لمجموعة الفرق ملزمة لتقييم نوعي ملزمة. التحليل الكمي أن يكشف 2.05 و 0.13 نانومتر يعني وحظ البصرية تغيير الارتفاع لهائل سعيد أنعم والبقع الأرنب مفتش الحكومة ، على التوالي ، للحصول على حضانة المضادة للتركيز هائل سعيد أنعم من 500 نانوغرام / مل.
الشكل 3 يظهر قياس IRIS من الاعتماد على البروتين ملزمة على الفور تركيز البروتين وقليل وحدات dsDNA طول. يوضح الرسم البياني العلوي المطلق قياسات ارتفاع البصرية الأولية لتحقيق ارتفاعات يجمد وبعد قليل وحدات حضانة ملزمة الفور. أدى تركيز متزايد من الفراء (50 ، 100 ، 200 نانومتر) في ملزمة لزيادة تحقيقات الحمض النووي. طول oligomers الآثار أيضا ملزمة الفور مع سلاسل أطول مما أسفر عن أكثر إلزاما. هنا ، وأشرطة الخطأ تمثل واحدة في قيمة الانحراف المعياري عن المتوسط. المؤامرة أسفل معارض محسوب ديمر البروتين الفراء ملزمة لكل dsDNA حبلا. وحدثت زيادة كبيرة في ديمر ملزمة الفور تركيز البروتين من 200 نانومتر يشير الى مستوى عال من غير محددة وملزمة.
الشكل 1. تخطيطي للمثال مجموعة التحقيق التي تستخدم عادة في تجربة للكشف عن الفيروسات والمكونات الفيروسية محددة بطريقة المضاعفة مع نظام IRIS.
الشكل 2. الحضانة بعد صورة الفرق للربط من الأجسام المضادة البشرية ألبومين المصل محددة لHSA رصدت جمعها مع هذا النظام التسمية خالية عند تركيز 500 نانوغرام / مل. يتم تحديد كثافة كتلة بيولوجية لكل بقعة ضوئية المعلومات عن طريق حساب متوسط سماكة ضمن بقعة ثم يقارن هذا مع متوسط من الحلقة حول البقعة التي تمثل الخلفية.
الشكل 3. قطعة من ربط البيانات للتفاعل مع البروتين الفراء oligomers المزدوج تقطعت بهم السبل رصدت مع تسلسل الآراء المعروفة القائمة على طول قليل وحدات ، والموقع من تسلسل توافق في الآراء داخل قليل وحدات ، والفراء تركيز البروتين. ويمكن استخدام المعلومات حول القيمة المطلقة للبروتين الفراء منضمة إلى كل تسلسل رصدت (أعلى) لتقدير عدد dimers الفراء ملزمة لكل نوع من قليل وحدات (القاع).
Discussion
منصة آيريس هو نظام بسيط وسريع لاستخدامها لجمع بيانات عالية الإنتاجية في شكل ملزم ميكروأري. بواسطة تساهميا شل حركة وظيفية مختلفة البروتين أو الحمض النووي تحقيقات على سطح المستضدات الهدف / المؤشرات الحيوية / الخ. ويمكن التقاطها من الحل ، كما هو الحال في المناعة. قياس هذه التفاعلات عبر ظروف التحقيق في نقطة أو تنسيق في الوقت الحقيقي مع نظام IRIS يسمح للحصول على معلومات حساسة للغاية والكمية التي سيتم جمعها عن كل التفاعل. تجربة مفصلة ممثل هنا هو مجرد مثال واحد من أنواع التفاعلات التي يمكن دراستها مع هذه التقنية. وقد تبين من الكشف عن عوامل النسخ ، مولدات المضادات الفيروسية ، والفيروسات ، ويمثل كامل سبق مجرد أمثلة قليلة من أنواع التحليلات التي يمكن التعامل معها على IRIS بسهولة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر Zoiray تكنولوجيز ، وهو شريك في رعاية وتسويق ، لدعمها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
- Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
