Summary
免费的生物分子检测定量，高通量，实时，标签（DNA，蛋白质等）上的二氧化硅
Abstract
敏感的生物分子相互作用的测量已在许多领域和行业，如基础生物学和微生物学，环境/农业/生物防御的监测，纳米生物技术，以及更多的使用。对于诊断的应用，监测（检测）存在的情况下，或有针对性的蛋白质组或基因组的生物标志物在患者的样本中发现的异常表达，可用于确定治疗方法或治疗的疗效。在研究领域，分子的亲和力和特异性的信息是有用的，为充分刻画调查系统。
许多人依靠，以确定分子的浓度或亲疏当前系统使用的标签。这些系统的例子包括，如酶联免疫吸附试验（ELISA），聚合酶链反应（PCR）技术，凝胶电泳分析，质谱（MS）的免疫。一般来说，这些标签的荧光，放射性，或在性质比色法，都直接或间接利益的分子靶点。虽然使用的标签已被广泛接受，并有一定的好处，也有缺点是刺激开发新的无标签的方法测量这些相互作用。这些弊端包括实用方面，如增加检测成本，试剂的寿命和可用性，存储和安全问题，浪费时间和努力，在标签，由于标签的过程或标签本身，不同的试剂之间的变异。在科学调研的基础上，使用这些标签也可以引进，如与蛋白质的功能/结构由于存在所附的标签和无法直接测量实时交互影响的担忧的困难。
这里介绍的是使用一个新的无标签的光学传感器，是适合芯片研究，被称为干涉反射成像传感器“（IRIS），用于检测蛋白质，DNA的抗原物质，整个病原体（病毒体）和其他生物材料。 “综合注册资讯系统”已被证明有不同的生物分子相互作用[1-3]高灵敏度，精密度和重现性。其优点包括多元化的成像能力，实时性和端点测量能力，和其他高通量的属性，如减少试剂的消耗和减少检测时间。此外，“综合注册资讯系统”平台使用简单，需要廉价的设备，并利用基于硅的固相检测元件，使得它与许多现代表面化学方法兼容。
在这里，我们目前的“综合注册资讯系统”的使用从探针阵列的制备孵化和测量目标端点格式的结果分析结合。该模型系统将被捕获抗体人血清白蛋白（HSA）的HSA斑基板上的具体目标。
Protocol
1。基材的准备
- 涂层层状硅SiO 2的基板与自我吸附的共聚物（DMA的NAS地图） ：
- 共聚物的合成，化学结构和镀膜工艺，发表在：G. Pirri E. Bontempi，楼大明，布加，乐Depero。吸附DNA微阵列玻片聚合物涂料的表征。肛门。 CHEM。 2004年，76，1352年至1358年。
- 简单地说，准备加入去离子（DI）水5毫升100毫克聚合物聚合物溶液，并添加5毫升40％饱和硫酸铵（（NH 4）2SO 4）解决方案的终浓度达到0.92米
- 淹没在摇床30分钟的解决方案，然后芯片离子水彻底冲洗。氩/ N 2气体彻底干燥。
- 烘烤芯片在80 ° C为15分钟。
- 商店聚合物涂层基板/芯片在干燥的环境（真空干燥器）中长达3个月，直到探针斑点程序。
2。制备探针阵列：抗体，抗原，SS /双链DNA和RNA等。
- 稀释探头（S），以适当的浓度所需的缓冲区。这一步可以有很大的不同，但一个典型的实验中利用在磷酸盐（0.5毫克/毫升的浓度范围为0.1 -1毫克/毫升）的抗原或抗体在pH≈7.4缓冲液（PBS）。
- 将解决方案，在96 - 或384孔板（或标准源板的去污剂的正在使用）
- 安装程序发现所需的印刷阵列的参数：表面和正在使用的解决方案，确定相应的斑点参数（停留时间，接近速度等）。确定每人电网，电网布局，复制电网，以及所需的斑点在芯片上的位置的条件复制的数量。将基板和源盘在适当的地点，进行检查，以确保废物和供应瓶准备，并开始印刷运行。
- 完成后斑点在高湿度环境中放置基板一夜之间（4-18小时），允许固定和失活过程进行。
- 洗净基板：三个独立的清洗三分钟以下解决方案：PBS 0.1％吐温（PBST），PBS，终于去离子（DI）水。根据不同类型的实验（湿与干），干燥彻底芯片与氩气，并开始孵化，或放置在流室芯片和组装。
- 停用共聚物表面剩余的NHS的群体，淹没50毫米，30分钟调整至7.4，而在摇床板的pH值在乙醇胺解决方案的芯片。一个主要的含胺化合物，如羟胺或三也可以使用，只要准备的解决方案是安全的使用与蛋白质。用PBS然后去离子水彻底冲洗停用的解决方案。
- 可选步骤（取决于被雇用的表面化学）：块面使用，酪蛋白，牛血清白蛋白的解决方案或水化30分钟牛奶。对于我们使用的聚合物表面化学，我们不执行此步骤，为聚合物骨架行为，以防止非特异性蛋白结合。
3。数据采集和孵化过程：终结点格式
- 做一个解决方案的目标所需的缓冲区的兴趣。在这里，将适当浓度的抗BSA在PBS（例如：1-10毫升10毫微克/毫升抗BSA在PBS溶液）的解决方案。此外，还要确保有一个同等数额的缓冲区（没有目标）为阴性对照孵化。
- 以一个正常化随后收集到的所有数据的硅镜扫描。
- IRIS系统的准备探针阵列扫描前的孵化步骤，以确定在每一个点（质量）的初始光高度。这将允许在表面上质量的变化进行适当的分析，即具有约束力的水平，孵化后。在这里，将调整为目前的实验，如：曝光时间，视野，繁荣重点等几个参数
- 浸没芯片（S），在摇床板1小时准备的解决方案。躁动水平有很大的不同，潜伏期的时间可以有所不同，目标浓度被检测到，流室的传输特性（如果正在使用一个实时检测模式），目标探针对等的亲和力， 。
- 孵化后，重复步骤2.5中所描述的洗涤程序）
- 扫描相同的探针阵列，使用“综合注册资讯系统”，并获得预孵化比较孵化后的图像。
- 重复这个过程中，如有必要，不同的孵化步骤，例如在一个正在使用其中一个次要的抗体夹心法格式。
4。数据分析
- 适合每个虹膜扫描（强度图像序列）收集到的图像，使用该实验室开发的软件亲杜奇探头阵列，包含光学厚度信息的图像。减去（注册）后和预孵化的图像都可以通过一个有约束力的快速定性分析。绑定将出现在那些质量变化观察点的强度变化。进行定量分析，确定每一个点的质量密度相比，平均为每个像素的光学厚度信息，并当场在现货和环外一个直接比较，这两个领域的背景。
5。代表性的成果：
图1显示了层状硅SiO 2的虹膜具有代表性的抗体阵列发现基板的例子原理。每个抗体合奏发现的不同，针对不同的蛋白质抗原表位的特异性复制。代表了两种不同的全病毒和病毒蛋白为例目标。阴性对照抗体依赖于检测，并可以非特异性和/或病毒特异性。
图2显示了人血清白蛋白（HSA）的结合特定抗体的发现HSA和兔IgG（对照组）点的数组。在这里看到，经过装修和光学测定厚度为前和孵化后的图像，图像可以创建一个绑定数组的区别，定性评估约束力。定量分析表明，一个2.05和0.13纳米意味着光高度变化的HSA和兔IgG点观察，分别为500毫微克/毫升抗血清白蛋白孵育浓度，。
图3显示了IRIS毛皮蛋白约束力的依赖，对蛋白质的浓度和dsDNA低聚物长度测量。顶部的图形显示绝对光高度测量，初步固定的低聚物探头高度和孵化后的毛皮约束力。毛皮浓度的增加（50，100，200纳米）增加DNA探针的结合。低聚物的长度也影响毛皮较长，更有约束力的结果序列的结合。在这里，误差棒代表平均值的标准偏差。下图显示计算毛皮每双链DNA链结合蛋白二聚体。二聚体约束力显着增加，表明非特异性结合的高层次的200纳米的毛皮蛋白质浓度。
图1：通常在实验中检测特定的病毒和病毒成分与“综合注册资讯系统”的复时尚使用的一个例子探头阵列的原理图。
图2。孵化后发现人血清白蛋白人血清白蛋白特异性抗体结合的差图像与此标签系统收集了500毫微克/毫升的浓度。生物材料的质量密度为每一个点是由平均光学厚度在现场信息，然后比较平均的环围绕当场背景。
图3。剧情发现双链与共识的基础上的低聚物长度，低聚物的共识序列位置内，和毛皮蛋白浓度已知序列的低聚物的毛皮蛋白质相互作用的数据绑定。绑定到每个发现序列（顶部）的毛皮蛋白绝对量的信息可以被用来估计绑定到每种类型的低聚物（底部）的毛皮二聚体。
Discussion
IRIS平台是一个简单而快速的系统，用于收集在一个芯片格式的高通量数据绑定。通过不同功能的蛋白质或DNA探针共价固定在表面上，靶抗原/生物标志物的/ etc。可以捕获从溶液中，在免疫分析。测量这些相互作用的跨端点或实时格式的IRIS系统的探头条件允许为高度敏感和定量的信息收集每个交互。这里详细的代表实验只是一个例子，可以使用这种技术研究相互作用的类型。转录因子，病毒抗原，和整个病毒的检测已经证明，以前只是一个代表的类型分析，光圈可以轻松地处理的几个例子。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢的支持Zoiray科技公司，共同提案国和商业化的合作伙伴，。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
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- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
