Biomolekylära Detection anställa interferometriska Sensor Reflektans Imaging (IRIS)

Summary

Kvantitativa, hög genomströmning, i realtid, och etikett-fri biomolekylär detektion (DNA, protein, etc.) på SiO

Abstract

Den känsliga mätning av biomolekylära interaktioner har användning inom många områden och branscher som grundläggande biologi och mikrobiologi, miljö / jordbruk / bioförsvar övervakning, nanobioteknik och mycket mer. För diagnostiska tillämpningar, (upptäcka) övervaka förekomsten, avsaknaden eller onormalt uttryck av riktade proteomik och genomik biomarkörer som finns i patientprover kan användas för att bestämma behandlingsmetoder eller terapi effekt. I forskningen arenan, information om molekylära tillhörighet och särdrag är användbara för fullt karakterisera de system som undersöks.

Många av de nuvarande systemen för att bestämma molekylära koncentrationer eller släktskap förlita sig på användningen av etiketter. Exempel på dessa system ingår immunoanalyser som enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), polymeraskedjereaktion (PCR) teknik, gel analyser elektrofores och masspektrometri (MS). Generellt dessa etiketter är fluorescerande, radiologiska eller kolorimetriska i naturen och är direkt eller indirekt knutna till molekylära målet av intresse. Även användningen av etiketter är allmänt accepterad och har vissa fördelar, finns nackdelar som stimulerar utvecklingen av nya etikett-fri metoder för att mäta dessa interaktioner. Dessa nackdelar inkluderar praktiska aspekter såsom ökad analys kostnad, reagens livslängd och användbarhet, lagring och säkerhetsproblem, bortkastad tid och kraft på märkning och variationsrikedomen bland de olika reagenser på grund av märkning, eller etiketter själva. På en vetenskaplig forskning grund kan använda dessa etiketter införa också svårigheter som gäller med effekter på proteiner fungerar / struktur på grund av förekomsten av den bifogade etiketter och oförmågan att direkt mäta interaktioner i realtid.

Presenteras här är att använda en ny etikett utan optisk biosensor som är mottaglig för microarray-studier, det så kallade interferometriska Reflektans Imaging Sensor (IRIS), för att upptäcka proteiner, DNA, antigena material, hela patogener (virioner) och annat biologiskt material. IRIS-systemet har visat sig ha hög känslighet, precision och reproducerbarhet för olika biomolekylära interaktioner [1-3]. Fördelarna är bland annat förmågan multiplex avbildning, i realtid och endpoint kapacitet mätning, och andra med hög genomströmning attribut såsom minskad reagensförbrukningen och en minskning av analys gånger. Dessutom är IRIS-plattformen enkel att använda, kräver billig utrustning och använder kiselbaserade Solid Components fas-analysen vilket gör den kompatibel med många moderna metoder ytkemi.

Här presenterar vi användning av IRIS-systemet från förberedelse av givare matriser för inkubation och mätning av mål bindning till analys av resultaten i en endpoint-format. Modellen Systemet kommer att tillfångatagandet av mål antikroppar som är specifika för humant serumalbumin (HSA) på HSA-spotted substrat.

Protocol

1. Förbehandling

1. Coat lager kisel-SiO _2-substrat med själv-adsorbera copoly (DMA-NAS-MAPS):
   1. Sampolymer syntes, kemiska struktur och beläggningsprocessen publiceras i: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Karakterisering av en Adsorberat Polymera beläggning för DNA microarray glasskivor. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358.
   2. Kortfattat, förbereda polymer lösning genom att tillsätta 100 mg polymer till 5 ml avjoniserat (DI) vatten och tillsätt 5 ml 40% mättade ammoniumsulfat ((NH ₄₎ 2so ₄₎ lösning för att nå en slutlig koncentration av 0,92 M.
   3. Sänk chips i lösningen för 30 min på en shaker och skölj sedan ordentligt med DI-vatten. Torka noggrant med Argon / N ₂ gas.
   4. Grädda chips vid 80 ° C i 15 min.
2. Förvara polymerbelagda substrat / marker i en torr miljö (vakuumexsickator) i upp till 3 månader tills sonden spotting förfarande.

2. Beredning av Probe Array: Antikroppar, antigen, SS / dsDNA, RNA, etc.

1. Späd sond (s) till lämplig koncentration i önskad buffert. Detta steg kan variera kraftigt, men ett typiskt experiment använder antigen eller IgG vid en koncentration av 0,5 mg / ml (intervall 0,1 -1 mg / ml) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid pH ≈ 7,4.
2. Placera lösningar i en 96 - eller 384-brunnars platta (eller standard källa platta för spotter som används vara)
3. Inställning spotting parametrar för önskad tryckt array: fastställa lämpliga spotting parametrar för ytan och lösningar som används (uppehållstid, tillvägagångssätt hastigheter, etc.). Bestäm antalet replikat av varje villkor per nät, nätet layouten, antalet replikera nät, och den önskade spotting plats på chipet. Placera substrat och källa plattan i lämpliga platser, kontrollera att avfallet och utbudet flaskor är redo, och börja skriva springa.
4. Efter spotting är klar plats substrat i miljöer med hög luftfuktighet över natten (4-18 timmar) för att möjliggöra immobilisering och avaktivering processen att fortsätta.
5. Tvätta substrat: placera dem i följande lösningar i tre minuter för tre olika tvättar: PBS med 0,1% Tween (PBST), PBS, och slutligen avjoniserat (DI) vatten. Beroende på vilken typ av experiment (våt vs torr), torra marker noga med argongas och börja inkubation eller placera marker i ett flöde kammare och montera.
6. Inaktivera kvarvarande NHS grupper på copolymer ytan genom att sänka ned marker i en 50 mM lösning av etanolamin med pH-värdet justeras till 7,4 i 30 minuter medan en shaker tallrik. En primär amin-innehållande föreningar som hydroxylamin eller Tris kan också användas så länge den beredda lösningen är säker att använda med proteiner. Skölj avaktivering lösning med PBS sedan DI-vatten.
7. Valfritt steg (beroende på ytkemi vara anställd): Blockera ytan med en lösning av BSA, kasein, eller uppblött mjölk i 30 minuter. För den nuvarande polymera ytkemi som vi använder, utför vi inte detta steg eftersom polymeren ryggraden agerar för att förhindra att icke-specifik proteinbindning.

3. Datainsamling och Inkubering Procedure: Endpoint format

1. Gör en lösning av målet av intresse i önskad buffert. Här kommer det att bli en lösning av lämplig koncentration av anti-BSA i PBS (ex: att 1-10 ml av en 10 ng / ml lösning av Anti-BSA i PBS). Se också till att ha en motsvarande mängd buffert (utan mål) för negativ kontroll inkubation.
2. Ta en skanning kisel spegel för att normalisera alla senare insamlade data.
3. Skanna beredd sonden array med IRIS-systemet före inkuberingssteget att kontrollera den initiala optiska höjd (vikt) vid varje plats. Detta kommer att möjliggöra en ordentlig analys av förändringar i massan på ytan, det vill säga graden av bindande efter inkubation. Här kommer några parametrar justeras för den aktuella experimentet, såsom exponeringstid, synfält, blomstrande fokus, etc.
4. Sänk chip (er) i beredd lösning för en timme på en shaker tallrik. Inkubationstiden kan variera avsevärt beroende på graden av upprördhet, är koncentrationen av målet upptäcks, transport egenskaper flödet kammare (om en realtidsdetektion läge används), den tillhörighet av målet-probe par, etc. .
5. Efter inkubation upprepa tvätta förfarande som beskrivs i steg 2,5)
6. Scan samma prob arrayen med IRIS-systemet och få efter inkubation bilder för före inkubation jämförelse.
7. Upprepa denna process för olika inkubation stegen om så behövs, till exempel i en sandwich assay format där en sekundär antikropp som används.

4. Data Analysis

1. Montera in bilder för varje IRIS scan (sekvens av intensitet bilder), med hjälp av lab-utvecklad programvara till ProDuce en bild av sonden array som innehåller optisk tjocklek information. En snabb kvalitativ analys av bindande kan göras genom att subtrahera (registrerade) post-och pre-inkubation bilder. Bindande kommer att visas som en förändring i intensitet på de platser där massa förändringar observerades. För kvantitativ analys, bestämma massan tätheter av varje plats jämfört med den bakgrunden som genomsnittet av optisk tjocklek information för varje pixel i en plats och en annulus utanför plats och göra en direkt jämförelse av dessa två områden.

5. Representativa resultat:

Figur 1 visar ett exempel schematiskt i lager Si-SiO ₂ IRIS substrat fläckig med en representant antikropp array. Varje antikropp ensemble är fläckig i replikera med specificitet för en annan epitop inriktade på olika proteiner. Två olika helt virus och en viral protein representeras som exempelvis mål. Negativ kontroll antikroppar beror på analysen och kan icke-specifika och / eller virus-specifika.

Figur 2 visar att delar av humant serumalbumin (HSA)-specifika antikroppar mot en rad fläckig HSA och kanin IgG (kontroll) fläckar. Som ses här, efter montering och bestämning av den optiska tjocklek för pre-och post-inkubation bilder kan en skillnad på bilden för en bindande array skapas för att kvalitativt bedöma bindande. Kvantitativ analys visar att en 2,05 och 0,13 nanometer menar optiska höjdskillnad observerades för HSA och kanin IgG fläckar, respektive, för en anti-HSA inkubation koncentration av 500 ng / ml.

Figur 3 visar en IRIS-mätning av Fur proteinbindning beroende av protein koncentration och dsDNA oligomerer längd. Den övre grafen visar absoluta optiska höjd mätningar för första immobiliserade höjder oligomerer sond och efter inkubation Fur bindande. Ökande koncentrationer av Fur (50, 100, 200 Nm) resulterade i ökad bindning till DNA-prober. Längden på oligomerer påverkar också Fur bindande med längre sekvenser resulterar i mer bindande. Här felstaplar representerar en standardavvikelse från medelvärdet. Den nedre tomten visar beräknade dimer Fur proteinbindning per dsDNA strand. Dimer bindande var signifikant ökat i Fur proteinkoncentration på 200 Nm vilket tyder på en hög nivå av icke-specifik bindning.

Figur 1. Schematisk ett exempel sond array som normalt används i ett experiment för att påvisa specifika virus och virala komponenter i en multiplexade mode med IRIS-systemet.

Figur 2. Post-inkubation skillnad på bilden för en bindning av humant serumalbumin-specifika antikroppar mot fläckiga HSA samlas in med denna etikett-free-system i en koncentration av 500 ng / ml. Den biomaterial massa densitet för varje plats bestäms som genomsnittet optisk tjocklek information inom en plats och sedan jämföra detta med ett genomsnitt av ett annulus runt platsen representerar bakgrunden.

Figur 3. Plotta av bindande data för interaktioner Fur protein med prickiga dubbel-strängat oligomerer med en känd konsensus sekvens bygger på oligomerer längd, placering av konsensus sekvensen inom oligomerer, och päls proteinkoncentration. Information om den absoluta mängden Fur bundet till varje prickig sekvens (överst) kan användas för att uppskatta antalet Fur dimerer bundna till varje typ av oligomerer (botten).

Discussion

IRIS-plattformen är ett enkelt och snabbt system att använda för att samla in high-throughput bindande data i en microarray format. Genom kovalent immobilisera olika funktionella proteiner eller DNA-prober på en yta, mål antigener / biomarkörer / etc. kan fångas av lösningen, som i en immunoassay. Mätning av dessa interaktioner mellan sond förhållanden i en endpoint eller realtid format med IRIS-systemet tillåter mycket känslig och kvantitativ information som skall samlas in för varje interaktion. Representanten Experimentet beskrivs här är bara ett exempel av de typer av interaktioner som kan studeras med denna teknik. Upptäckt av transkriptionsfaktorer, virusantigener, och hela virus har visats tidigare och representerar bara några exempel på de typer av analyser som IRIS lätt kan hantera.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide	Silicon Valley Microelectronics
Ammonium sulfate powder	Sigma-Aldrich	A5132
Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate	Fisher Scientific	BP665-1
Antibody to human serum albumin (Anti-HSA)	Sigma-Aldrich	A0433
Human serum albumin (HSA)	Sigma-Aldrich	A9511
Argon or nitrogen gas (ultra-high purity)	Airgas	AR UHP300 or NI UHP300
Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	0875713A
Scienceware® vacuum desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-120
96-well plates, low cell binding	Nalge Nunc international	145399
BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer	Bio-Rad
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Hydroxylamine	Thermo Fisher Scientific, Inc.	26103
Multi-purpose rotator, model # 2314	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314Q
Retiga 2000R camera	QImaging	01-RET-2000R-F-M-12
AcuLED illumination source	PerkinElmer, Inc.
Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.)	Thorlabs Inc.