Summary
SiO Kantitatif, yüksek verimli, gerçek zamanlı ve etiket ücretsiz biyomoleküler algılama (DNA, protein, vb.)
Abstract
Biyomoleküler etkileşimlerin hassas ölçüm temel biyoloji ve mikrobiyoloji, çevre / tarım / biodefense izleme, nanobioteknoloji, ve daha fazlası gibi birçok alanda ve sanayi kullanımı vardır. Teşhis uygulamaları, izleme (tespit), varlığı, yokluğu, veya hasta numunelerinin bulunan hedef proteomik veya genomik biyobelirteçleri anormal ifade tedavi yaklaşımları ya da tedavi etkinliğini belirlemek için kullanılan olabilir. Araştırma arenası, moleküler yakınlık ve özelliklerle ilgili bilgi sistemleri tam olarak soruşturma altında tanımlamak için yararlıdır.
Moleküler konsantrasyonları ya da yakınlık belirlemek için kullanılan mevcut sistemlerinin çoğu etiket kullanımı güveniyor. Bu sistemlerin örnekleri enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA), polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri, jel elektroforezi deneyleri ve kütle spektrometresi (MS) gibi immunoassay içerir. Genellikle, bu etiketler, floresan radyolojik, ya da doğada kolorimetrik ve doğrudan ya da dolaylı olarak ilgi moleküler hedef bağlıdırlar. Etiket kullanımı yaygın olarak kabul görmüş ve bazı faydaları da vardır olmasına rağmen, bu etkileşimlerin ölçmek için yeni bir etiket içermeyen yöntemler geliştirilmesi teşvik sakıncaları vardır. Bu sakıncaları tahlil maliyet artış, reaktif ömrü ve kullanılabilirlik, depolama ve güvenlik kaygıları gibi pratik yönleriyle, etiketleme harcanan zaman ve çaba, ve etiketleme işlemleri veya etiket kendilerini nedeniyle farklı reaktifler arasında değişkenlik içerir. Bir bilimsel araştırma temelinde, bu etiket kullanımı da, protein işlevselliği / yapıştırılan etiketlere ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak doğrudan ölçmek için yetersizlik varlığı nedeniyle yapısı üzerindeki etkileri ile endişeler gibi zorluklar tanıtabilirsiniz.
Burada sunulan çalışmalar mikroarray mükellef yeni bir etiket ücretsiz bir optik biyosensör kullanımı, İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensör tespit proteinler, DNA, antijenik malzeme, tüm patojenler (virionlar) ve diğer biyolojik materyalin (IRIS) olarak adlandırılır. IRIS sistemi farklı biyomoleküler etkileşimleri [1-3] için yüksek duyarlılık, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik kanıtlanmıştır. Faydaları multipleks görüntüleme kapasitesi, gerçek zamanlı ve uç nokta ölçüm yetenekleri ve düşük reaktif tüketimi ve tahlil kez bir azalma gibi diğer yüksek verimlilik özellikleri içerir. Ayrıca, IRIS platformu, kullanımı kolay, ucuz ekipman gerektirir ve birçok çağdaş yüzey kimyası yaklaşımları ile uyumlu hale silikon tabanlı katı faz tayini bileşenleri kullanır.
Burada, kuluçka ve bir bitiş noktası formatında sonuçlarının analizi için bağlayıcı hedef ölçüm probu dizilerin hazırlanması IRIS sisteminin kullanımı sunuyoruz. Model sistem Kalkış Desteği (HSA) HSA-benekli yüzeylerde insan serum albumini için spesifik hedef antikor yakalamak olacaktır.
Protocol
1. Yüzey Hazırlığı
- Coat katmanlı silikon-SiO 2 substratlar kendi kendine adsorblama copoly (DMA-NAS-MAPS):
- Kopolimer sentezi, kimyasal yapı ve kaplama işlemi yayımlanır: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. DNA Mikroarray Cam Slaytlar Polimerik Adsorbe Kaplamanın Karakterizasyonu. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358.
- Kısaca, polimer 100 mg 5 ml deiyonize (DI) su ekleyerek polimer çözüm hazırlamak ve nihai konsantrasyonu 0.92 M. ulaşmak için 5 ml% 40 doymuş amonyum sülfat ((NH 4) 2SO 4) çözümü eklemek
- Çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca çözüm ve daha sonra Batmak cips DI suyla iyice durulayın. Argon / N 2 gaz ile iyice kurulayın.
- 80 Bake cips ° C 15 dk.
- Mağaza polimer kaplı yüzeylerde 3 ay kadar kuru bir ortamda (vakum desikatöre) / cips prob prosedürü lekelenme kadar.
2. Antikorlar, antijenler, ss / dsDNA, RNA, vb: Probe Array hazırlanması
- Istenilen tampon uygun konsantrasyon prob (ler) seyreltilir. Bu adım önemli ölçüde değişir olabilir, ancak tipik bir deney pH ≈ 7.4 tamponlu salin (PBS), fosfat, 0.5 mg / ml konsantrasyonu (0.1 -1 mg / ml aralık) antijen veya IgG kullanır.
- 96 çözümleri - 384 plaka (veya spotter kullanılan standart kaynak plaka)
- Istenen basılı dizi için parametreleri tespit Kurulum: (durmak kez, yaklaşım hızları vb), kullanılan yüzey ve çözümleri için uygun lekelenme parametreleri belirlemek. Izgara, ızgara düzeni, sayısını çoğaltmak ızgaraları, ve çip üzerinde istenilen konuma lekelenme başına her durumun tekerrür sayısını belirler. Yeri yüzeyleri ve uygun yerlerde kaynak plakası, emin atık ve tedarik şişeleri hazır olmak için kontrol ve baskı vadede başlar.
- Lekelenme immobilizasyonu ve devre dışı bırakma sürecinin devam etmesi için (4-18 saat) yüksek nemli ortamlarda yer substratlar gecede bittikten sonra.
- Yıkama yüzeyler:% 0.1 Tween (PBST), PBS ve nihayet deiyonize (DI) su ile PBS üç ayrı yıkama için üç dakika için aşağıdaki çözümleri yer onları. Deney türüne göre (ıslak vs kuru), Argon gazı ile çip iyice kurulayın ve inkübasyon başlamak veya bir akış odasında çip yerleştirmek ve montajını.
- Çalkalayıcı plaka sırasında 30 dakika boyunca 7.4 'e, düzeltilmiş pH ile etanolamin 50 mM çözüm cips daldırarak kopolimer yüzey üzerinde kalan NHS gruplar devre dışı bırakın. Hidroksilamin veya Tris gibi bir birincil amin içeren bileşik aynı zamanda uzun zamandır hazırlanan bir çözüm proteinleri ile kullanmak için güvenli olarak kullanılabilir. PBS sonra DI su kullanarak devre dışı bırakma çözüm iyice durulayın.
- İsteğe adım (istihdam edilen yüzey kimyası bağlı olarak): BSA, kazein, çözüm ya da 30 dakika boyunca rehidrate süt kullanarak Blok yüzey. Polimer omurgası, non-spesifik protein bağlama önlemek için eylemi olarak bizim kullandığımız mevcut polimerik yüzey kimyası için, bu adımı gerçekleştirmeniz yok.
3. Veri Toplama ve Kuluçka Prosedür: Endpoint formatı
- İstenen tampon ilgi hedef bir çözüm olun. Burada, uygun konsantrasyonu PBS içinde Anti-BSA (eski), 10 ng / ml PBS içinde Anti-BSA çözüm 1-10 ml yapmak bir çözüm olacaktır. Ayrıca, negatif kontrol inkübasyon için tampon (hedef) eşdeğer bir miktarda olduğundan emin olun.
- Daha sonra toplanan tüm veriler normalleştirilmesi için silikon ayna tarama atın.
- Her bir noktada, ilk optik yüksekliği (kütle) belirlemek için önce inkübasyon adım IRIS sistemi ile hazırlanan prob dizi tarayın. Bu yüzey üzerine kitle değişiklikleri doğru analiz için izin verecek, inkübasyondan sonra, bağlama yani. Burada, birkaç parametre mevcut maruz kalma süresi gibi deney, görüş alanı, prospering odaklama, vb çekilecektir
- Çalkalayıcı plaka üzerinde 1 saat için hazırlanan çözüm Batmak çip (ler). Inkübasyon süresi önemli ölçüde ajitasyon düzeyine bağlı olarak değişebilir, konsantrasyonu hedef tespit, akış odasının taşıma özellikleri (gerçek zamanlı algılama modu kullanılıyor ise), hedef prob çifti akrabalıklar, vb. .
- Inkübasyondan sonra) adım 2.5 'te açıklanan yıkama prosedürü tekrarlayın
- IRIS sistemi kullanarak aynı prob dizi Tarama ve ön-inkübasyon karşılaştırma sonrası inkübasyon görüntüler elde.
- Ikincil bir antikor kullanılan bir sandviç analiz formatında örneğin, gerekirse farklı inkübasyon adımlar için bu işlemi tekrarlayın.
4. Veri Analizi
- Pro laboratuvarı tarafından geliştirilen bu yazılım kullanarak, her IRIS tarama (yoğunluğu görüntüler dizisi) için toplanan görüntüler Fitprob dizi optik kalınlığı bilgileri içeren bir görüntü Duce. (Kayıtlı) post ve pre-inkübasyon görüntüler çıkarılarak bağlama hızlı bir nitel analiz yapılabilir. Bağlama toplu değişiklikler gözlenmiştir bu noktalarda yoğunluk bir değişiklik olarak görünecektir. Kantitatif analiz için, her bir nokta, nokta nokta ve anulus dış içinde ortalama her piksel için optik kalınlığı bilgileri ve bu iki alan doğrudan bir karşılaştırma yapmak arka plana göre kitle yoğunlukları belirler.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1, temsil eden bir antikor dizi ile tespit katmanlı Si-SiO 2 IRIS substrat bir örnek şematik gösterir . Her antikor topluluğu farklı proteinler hedefleyen farklı bir epitop için özgüllük ile çoğaltmak fark edilir. İki farklı tüm virüsler ve viral bir proteinin, örneğin hedef olarak temsil edilmektedir. Negatif kontrol antikorları tahlil bağlıdır ve non-spesifik ve / veya virüs olabilir.
Şekil 2 (HSA) insan serum albumini bağlama gösterir bir dizi benekli HSA ve tavşan IgG (kontrol) lekeler için özel antikorlar. Burada görüldüğü gibi, inkübasyon öncesi ve sonrası görüntüler için optik montaj ve kararlılıkla sonra kalınlıkları, bağlayıcı bir dizi için bir fark görüntü niteliksel bağlayıcı değerlendirmek için oluşturulabilir. Kantitatif analiz, 2.05 ve 0.13 nanometre optik yüksekliğini değiştirmek, bir anti-HSA inkübasyon konsantrasyonu 500 ng / ml, sırasıyla, HSA ve tavşan IgG noktalar gözlendi demek ortaya koymaktadır.
Şekil 3, protein konsantrasyonu ve dsDNA oligomer uzunluğu Kürk protein bağlayıcı bağımlılığı bir IRIS ölçümü gösterir. Üst grafik ilk immobilize oligomer prob yükseklikleri ve post-inkübasyon Kürk bağlanma için mutlak optik boy ölçümleri gösterir. Kürk artan konsantrasyonlarda (50, 100, 200 nM) DNA probları artan bağlayıcı sonuçlandı. Oligomerlerinin uzunluğu da daha bağlayıcı uzun dizileri ile Kürk bağlanma etkiler. Burada, hata çubukları, ortalama bir standart sapmasını temsil eder. Alt arsa dsDNA iplikçik başına bağlayıcı hesaplanan Kürk protein dimer gösterir. Dimer bağlama, non-spesifik bağlayıcı bir üst düzey düşündüren 200 nM Kürk protein konsantrasyonu önemli ölçüde artış oldu.
Şekil 1, normalde çoğullanır moda IRIS sistemi ile belirli virüs ve virüs bileşenleri tespit etmek için bir deney kullanılan bir örnek prob dizi şematik .
Şekil 2 benekli HSA insan serum albumini-spesifik antikorların bağlanması için Post-inkübasyon fark görüntü 500 ng / ml konsantrasyonda bu etiket sistemi ile toplanır. Biyomateryal kitle yoğunluğu her nokta için bir nokta içinde ortalama optik kalınlığı bilgileri ve daha sonra bu arka plan temsil eden nokta civarında bir annulus ortalama ile karşılaştırarak belirlenir.
Şekil 3 oligomer uzunluğu, oligomer içinde fikir birliği dizisi yeri ve Kürk protein konsantrasyonu bilinen bir uzlaşı sırası ile benekli çift iplikli oligomerler Kürk protein etkileşimleri için veri bağlama Arsa. Mutlak her benekli dizisi (üst) bağlı Kürk protein miktarı hakkında bilgi oligomer (alt) her türüne bağlı Kürk dimerleri sayısını tahmin etmek için kullanılabilir.
Discussion
IRIS platformu mikroarray formatında yüksek verim bağlama veri toplamak için kullanmak için basit ve hızlı bir sistem. Kovalent bir yüzey üzerine farklı fonksiyonel bir protein ya da DNA probları hareketsizleştirir, hedef antijenleri / biyobelirteçleri / etc. immunoassay olduğu gibi, çözüm yakalanabilir. IRIS sistemi ile bir bitiş noktası ya da gerçek zamanlı biçimde prob koşullarında bu etkileşimlerin ölçümü, her etkileşim için tahsil edilecek son derece hassas ve kantitatif bilgi sağlar. Burada ayrıntılı temsilcisi deney, türleri, bu teknik ile incelenebilir etkileşimleri örneklerden sadece biridir. Transkripsiyon faktörleri, viral antijenleri, ve tüm virüsler Algılama, daha önce gösterilmiş ve IRIS kolayca işleyebilir analizler türleri sadece birkaç örnek temsil etmektedir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Zoiray Technologies Inc, bir co-sponsoru ve ticarileştirilmesi ortağı verdiği destekten ötürü teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
- Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
