نظهر تطبيق مؤشر مضان ، TMRM ، في العصبونات القشرية لتحديد التغيرات النسبية في كثافة مضان TMRM قبل وبعد تطبيق حافز معين. نعرض أيضا تطبيق H التحقيق مضان<sub> 2</sub> DCF – DA تقييم المستوى النسبي لأنواع الاكسجين التفاعلية في العصبونات القشرية.
غشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨm) أمر حاسم للحفاظ على وظيفة فسيولوجية من السلسلة التنفسية لتوليد ATP. خسارة كبيرة من الخلايا المنضب ΔΨm يجعل من الطاقة مع الموت لاحقة. أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) مهمة جزيئات الإشارة ، ولكن تراكمها في ظروف مرضية تؤدي الى الاكسدة. مصادر الرئيسيتين لريوس في الخلايا هي السموم البيئية وعملية الفسفرة المؤكسدة. وقد تسببت ضعف الميتوكوندريا والاكسدة في الفيزيولوجيا المرضية لكثير من الأمراض ، وبالتالي ، فإن القدرة على تحديد وΔΨm ريوس يمكن أن توفر مؤشرات مهمة عن حالة الفسيولوجية للخلية وظيفة من وظائف الميتوكوندريا.
ويمكن استخدام عدة تحقيقات فلوري (رودامين 123 ، TMRM ، TMRE ، JC – 1) لتحديد Δψm في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، وكثير من المؤشرات مضان (Dihydroethidium ، Dihydrorhodamine 123 ، H 2 DCF – DA) يمكن استخدامها لتحديد ريوس . ما يقرب من جميع التحقيقات مضان المتاحة المستخدمة لتقييم ΔΨm أو ريوس واحد الطول الموجي المؤشرات ، التي تزيد أو تنقص حدتها مضان النسبي إلى أن التحفيز الزيادة أو النقصان في مستويات ΔΨm أو ريوس. وهكذا ، فإنه لا بد من قياس كثافة مضان هذه التحقيقات على مستوى خط الأساس وبعد تطبيق حافز معين. هذا يسمح احد لتحديد النسبة المئوية للتغيير في كثافة مضان بين مستوى خط الأساس والحافز. هذا التغيير في كثافة مضان يعكس التغير في المستويات النسبية للΔΨm أو ريوس. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تطبيق مؤشر مضان ، TMRM ، في العصبونات القشرية الفئران لتحديد النسبة المئوية للتغير في كثافة مضان TMRM بين مستوى خط الأساس وبعد تطبيق FCCP ، وهو uncoupler الميتوكوندريا. انخفاض مستويات TMRM مضان الناتجة عن المعالجة FCCP تعكس الاستقطاب من إمكانات غشاء الميتوكوندريا. علينا أن نبين كيفية تطبيق مضان التحقيق H 2 – DA DCF لتقييم مستوى ريوس في الخلايا العصبية القشرية ، أولا في الأساس ثم بعد تطبيق H 2 O 2. يمكن أن يكون هذا البروتوكول (مع تعديلات طفيفة) تستخدم أيضا لتحديد التغيرات في ΔΨm وريوس في أنواع مختلفة من الخلايا والخلايا العصبية في المناطق المعزولة من الدماغ الأخرى.
قدمنا إجراء خطوة بخطوة يصف كيفية تحديد ΔΨm وريوس في العصبونات القشرية الفئران باستخدام المؤشرات TMRM الفلورسنت وDCF H 2 – DA ، على التوالي. لأنواع الخلايا الأخرى ، فمن المهم تحديد تجريبيا تركيز النهائي والوقت لتحميل TMRM أو H 2 – DA DCF. بوجه عام ، تتراوح التركيزات TMRM 2-20 نانومتر ، وفترة حضانة الخلية يختلف مع TMRM 20-60 دقيقة. تركيز النهائي من H 2 – DA DCF يتراوح 2-10 ميكرون ، وحضانة الخلايا في محلول يحتوي على تحميل هذا المؤشر يختلف 30-45 دقيقة.
من المهم لتحسين قوة الليزر وسرعة مسح أخذ الصور لتجنب كل الصور سمية للخلايا والتغيرات في كثافة مضان (على سبيل المثال من الخفقان مضان TMRM) في غياب أي حافز. وينبغي ضبط الأمثل الضوئية نتيجة في إشارة مضان التي لم تنته أو تحت المشبعة (العتبة) في غياب التحفيز. تتحقق الظروف المثلى لجمع الصور من حقل محدد في السلطة ليزر خاص وسرعة الفحص عندما تكون هناك أي تغييرات في كثافة مضان لجنة التحقيق في ظل غياب أي حافز لمدة 10-15 دقيقة من التصوير الحي.
مضان تحقيقات أخرى لتحديد ΔΨm رودامين تشمل 123 ورباعي إيثيل الميثيل رودامين استر (TMRE). ومع ذلك ، تم العثور عليها لكبح عمليات التنفس في 2 الميتوكوندريا المعزولة. الأهم من ذلك ، TMRM له أي تأثير على التنفس الميتوكوندريا في تركيزات منخفضة (2) ولقد الضيائية منخفضة وphotobleaching 3 بالمقارنة مع تحقيقات أخرى. H 2 – DA DCF يعد مؤشرا جيدا لريوس كما يتم الاحتفاظ جيدا في الخلايا ، ويعترف للأكسدة أنواع عدة ، مثل البيروكسيدات ، وأكاسيد فائقة ، وأكسيد النيتريك 4.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (K22NS050137 لJCB).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C |
NbActive4 | BrainBits | NbActive4 |
TMRM | Invitrogen | T668 |
H2DCF-DA | Invitrogen | C400 |
NaCl | Sigma | S6191 |
KCl | Sigma | P3911 |
CaCl2•2H2O | Sigma | C3306 |
MgCl2•6H2O | Sigma | M2670 |
D-Glucose | Sigma | G6152 |
HEPES | Invitrogen | 15630 |