Se demuestra la aplicación del indicador de fluorescencia, TMRM, en las neuronas corticales para determinar los cambios relativos en la intensidad de fluorescencia TMRM antes y después de la aplicación de un estímulo específico. También muestran la aplicación de la fluorescencia de la sonda H<sub> 2</sub> DCF-DA para evaluar el nivel relativo de especies reactivas del oxígeno en las neuronas corticales.
Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) es fundamental para mantener la función fisiológica de la cadena respiratoria para generar ATP. Una pérdida significativa de ΔΨm hace agotadas las células de la energía con la posterior muerte. Las especies reactivas del oxígeno (ROS) son importantes moléculas de señalización, pero su acumulación en condiciones patológicas conduce a estrés oxidativo. Las dos principales fuentes de ROS en las células son las toxinas ambientales y el proceso de fosforilación oxidativa. Disfunción mitocondrial y de estrés oxidativo han sido implicados en la fisiopatología de muchas enfermedades, por lo tanto, la capacidad de determinar ΔΨm y ROS pueden proporcionar pistas importantes sobre el estado fisiológico de la célula y la función de la mitocondria.
Varias sondas fluorescentes (Rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1) se puede utilizar para determinar Δψm en una variedad de tipos celulares, y muchos indicadores de fluorescencia (dihydroethidium, dihidrorodamina 123, H 2 DCF-DA) se puede utilizar para determinar ROS . Casi todas las sondas de fluorescencia que se utilizan para evaluar ΔΨm o ROS son de una sola longitud de onda de los indicadores, que aumentan o disminuyen su intensidad de fluorescencia proporcional a un estímulo que aumenta o disminuye los niveles de ΔΨm o ROS. Por lo tanto, es imprescindible para medir la intensidad de la fluorescencia de las sondas a nivel basal y después de la aplicación de un estímulo específico. Esto permite determinar el porcentaje de cambio en la intensidad de fluorescencia entre el nivel de referencia y un estímulo. Este cambio en la intensidad de la fluorescencia refleja el cambio en los niveles relativos de ΔΨm o ROS. En este video, que muestra cómo aplicar el indicador de fluorescencia, TMRM, en ratas las neuronas corticales para determinar el porcentaje de cambio en la intensidad de fluorescencia TMRM entre el nivel basal y después de aplicar FCCP, un desacoplador mitocondrial. Los niveles más bajos de TMRM fluorescencia que resulta del tratamiento FCCP reflejan la despolarización del potencial de membrana mitocondrial. También se muestra cómo aplicar la fluorescencia de la sonda H 2 DCF-DA para evaluar el nivel de ROS en las neuronas corticales, en primer lugar al inicio del estudio y después de la aplicación de H 2 O 2. Este protocolo (con modificaciones menores) también se puede utilizar para determinar los cambios en ΔΨm y ROS en diferentes tipos celulares y en neuronas aisladas de otras regiones del cerebro.
Hemos presentado un procedimiento paso a paso describe cómo determinar ΔΨm y ROS en ratas las neuronas corticales con el fluorescente TMRM indicadores y H 2 DCF-DA, respectivamente. Para otros tipos de células, es importante para determinar empíricamente la concentración final y el tiempo de carga de TMRM o H 2 DCF-DA. En general, la gama de concentraciones de 20 a 200 nM TMRM, y el tiempo de incubación de células con TMRM varía de 20 a 60 min. La concentración final de H 2 DCF-DA varía desde 2 hasta 10 M, y la incubación de las células en una solución de carga que contiene este indicador varía entre 30-45 minutos.
Es importante para optimizar la potencia del láser y la velocidad de escaneo de tomar las imágenes para evitar tanto la foto-toxicidad para las células y cambios en la intensidad de fluorescencia (por ejemplo, el parpadeo de TMRM fluorescencia) en ausencia de cualquier estímulo. Los ajustes ópticos optimizados debería resultar en una señal de fluorescencia que no es mayor o menor saturación (umbral) en ausencia de estímulo. Las condiciones óptimas para recoger las imágenes de un campo seleccionado en una potencia del láser en particular y una velocidad de escaneado se logra cuando no hay cambios en la intensidad de la fluorescencia de la sonda en la ausencia de cualquier estímulo durante 10-15 minutos de imágenes en vivo.
Otras sondas de fluorescencia para determinar ΔΨm incluyen rodamina 123 y tetra metil éster etílico rodamina (TMRE). Sin embargo, se encontró que inhibe los procesos respiratorios en dos mitocondrias aisladas. Es importante destacar que TMRM no tiene ningún efecto sobre la respiración mitocondrial en bajas concentraciones y tiene dos bajas y fototoxicidad photobleaching 3 en comparación con otras sondas. H 2 DCF-DA es un buen indicador de ROS como es bien retenido en las células y reconoce varias especies oxidantes, como peróxidos, óxidos de super, y el óxido nítrico 4.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (K22NS050137 a JCB).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C |
NbActive4 | BrainBits | NbActive4 |
TMRM | Invitrogen | T668 |
H2DCF-DA | Invitrogen | C400 |
NaCl | Sigma | S6191 |
KCl | Sigma | P3911 |
CaCl2•2H2O | Sigma | C3306 |
MgCl2•6H2O | Sigma | M2670 |
D-Glucose | Sigma | G6152 |
HEPES | Invitrogen | 15630 |