Мы демонстрируем применение флуоресценции индикатора, TMRM, в корковых нейронов, чтобы определить относительные изменения TMRM интенсивности флуоресценции до и после применения конкретных стимулов. Мы также показываем применения флуоресценции зонда Н<sub> 2</sub> DCF-DA для оценки относительного уровня активных форм кислорода в корковых нейронов.
Митохондриальная мембранного потенциала (ΔΨm) имеет решающее значение для поддержания физиологических функций дыхательной цепи для генерации АТФ. Значительные потери ΔΨm оказывает клетки обедненного энергии с последующей смерти. Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль сигнальных молекул, но и их накопление в патологических условиях приводит к окислительному стрессу. Два основных источника АФК в клетках являются экологические токсины и процесс окислительного фосфорилирования. Митохондриальной дисфункции и окислительного стресса были замешаны в патофизиологии многих заболеваний, поэтому способность определять ΔΨm и ROS могут предоставить важную информацию о физиологического состояния клетки и функции митохондрий.
Несколько флуоресцентных зондов (родамина 123, TMRM, TMRE, JC-1) может быть использована для определения Δψm в различные типы клеток, и многие флуоресценции показателей (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA), могут быть использованы для определения ROS . Почти все доступные зондов флуоресценции используется для оценки ΔΨm или ROS являются одной длине волны показателей, увеличение или уменьшение их интенсивности флуоресценции пропорциональна стимул, который увеличивает или уменьшает уровни ΔΨm или АФК. Таким образом, крайне важно для измерения интенсивности флуоресценции этих зондов на базовом уровне и после применения конкретных стимулов. Это позволяет определить процент изменения интенсивности флуоресценции от базового уровня и стимул. Это изменение в интенсивности флуоресценции отражает изменение относительных уровней ΔΨm или АФК. В этом видео показано, как применять флуоресценции индикатора, TMRM, у крысы корковых нейронов, чтобы определить процентное изменение TMRM интенсивности флуоресценции от базового уровня, и после применения FCCP, митохондриальная разобщающий агент. Более низкие уровни TMRM флуоресценции в результате лечения FCCP отражает деполяризацию митохондриального потенциала мембраны. Мы также показываем, как применять флуоресценции зонда H 2 DCF-DA оценить уровень АФК в корковых нейронов, во-первых в начале исследования, а затем после применения H 2 O 2. Этот протокол (с незначительными изменениями) может быть также использована для определения изменений в ΔΨm и АФК в различных типах клеток и нейронов, изолированы от других участков мозга.
Мы представили шаг за шагом описывающие процедуры, как определить, ΔΨm и АФК крыс нейроны коры использованием флуоресцентных индикаторов TMRM и Н 2 DCF-DA, соответственно. Для других типов клеток, важно, чтобы эмпирически определить конечную концентрацию и время загрузки для TMRM или H 2 DCF-DA. В общем, TMRM диапазоне концентраций от 20-200 нм, а время клетка инкубации с TMRM колеблется от 20 до 60 мин. Конечная концентрация H 2 DCF-DA составляет от 2-10 мкм, а инкубации клеток в растворе, содержащем загрузку этот показатель колеблется от 30-45 мин.
Очень важно для оптимизации мощности лазера и скорость сканирования взятия изображения, чтобы избежать как фото-токсичности для клеток и изменения в интенсивности флуоресценции (например мерцание TMRM флуоресценции) в отсутствие какого-либо стимула. Оптимизированные оптические параметры должны приводить к флуоресценции, не больше или меньше насыщенных (порог) в отсутствии стимула. Оптимальных условий для сбора изображений из выбранного поля в частности мощности лазера и скорость сканирования достигаются тогда, когда Есть никаких изменений в интенсивности флуоресценции зонда в отсутствие какого-либо стимула в течение 10-15 минут живого изображения.
Другие флуоресценции зондов для определения ΔΨm включают родамина 123 и тетра метил родамина этиловый эфир (TMRE). Тем не менее, они были найдены ингибировать дыхательные процессы в изолированных митохондриях 2. Важно отметить, что TMRM не оказывает влияния на дыхание митохондрий при низких концентрациях 2 и имеет низкую фототоксичности и фотообесцвечивания 3 по сравнению с другими датчиками. H 2 DCF-DA является хорошим показателем для АФК, как он хорошо сохраняется в клетках и распознает несколько видов окислителей, таких как перекиси, супер оксидов и оксида азота 4.
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (K22NS050137 к JCB).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C |
NbActive4 | BrainBits | NbActive4 |
TMRM | Invitrogen | T668 |
H2DCF-DA | Invitrogen | C400 |
NaCl | Sigma | S6191 |
KCl | Sigma | P3911 |
CaCl2•2H2O | Sigma | C3306 |
MgCl2•6H2O | Sigma | M2670 |
D-Glucose | Sigma | G6152 |
HEPES | Invitrogen | 15630 |