Nous démontrons l'application de l'indicateur de fluorescence, TMRM, dans les neurones corticaux de déterminer les changements relatifs d'intensité de fluorescence TMRM avant et après application d'un stimulus spécifique. Nous montrons aussi l'application de la fluorescence de la sonde H<sub> 2</sub> DCF-DA pour évaluer le niveau relatif des espèces réactives de l'oxygène dans les neurones corticaux.
Potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm) est essentiel pour maintenir la fonction physiologique de la chaîne respiratoire pour produire l'ATP. Une perte importante de ΔΨm rend les cellules épuisées d'énergie avec la mort subséquente. Espèces réactives de l'oxygène (ERO) sont importantes molécules de signalisation, mais leur accumulation dans des conditions pathologiques conduit au stress oxydatif. Les deux principales sources de ROS dans les cellules sont des toxines environnementales et le processus de phosphorylation oxydative. Dysfonction mitochondriale et le stress oxydatif ont été impliqués dans la physiopathologie de nombreuses maladies et, par conséquent, la capacité de déterminer ΔΨm et ROS peuvent fournir des indices importants sur l'état physiologique de la cellule et la fonction des mitochondries.
Plusieurs sondes fluorescentes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) peut être utilisée pour déterminer Δψm dans une variété de types de cellules, et de nombreux indicateurs de fluorescence (Dihydroethidium, dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) peut être utilisée pour déterminer les ROS . Presque toutes les sondes de fluorescence disponibles utilisés pour évaluer ΔΨm ou ROS sont une seule longueur d'onde des indicateurs, qui augmentent ou diminuent leur intensité de fluorescence proportionnelle à un stimulus qui augmente ou diminue les niveaux de ΔΨm ou ROS. Ainsi, il est impératif de mesurer l'intensité de fluorescence de ces sondes au niveau basal et après l'application d'un stimulus spécifique. Cela permet de déterminer le pourcentage de changement dans l'intensité de fluorescence entre le niveau de référence et un stimulant. Ce changement dans l'intensité de fluorescence reflète le changement dans les niveaux relatifs de ΔΨm ou ROS. Dans cette vidéo, nous démontrons comment appliquer l'indicateur de fluorescence, TMRM, chez le rat neurones corticaux de déterminer le pourcentage de variation de l'intensité de fluorescence TMRM entre le niveau de base et après l'application FCCP, un découplant mitochondrial. Les niveaux inférieurs de la fluorescence TMRM résultant du traitement FCCP refléter la dépolarisation du potentiel de membrane mitochondriale. Nous montrons aussi comment appliquer la fluorescence de sonde H 2 DCF-DA pour évaluer le niveau de ROS dans des neurones corticaux, d'abord au départ et puis après application de H 2 O 2. Ce protocole (avec des modifications mineures) peuvent être également utilisés pour déterminer les changements dans ΔΨm et ROS dans différents types cellulaires et dans les neurones isolés à partir d'autres régions cérébrales.
Nous avons présenté une procédure étape par étape décrivant comment déterminer ΔΨm et ROS dans les neurones corticaux de rat en utilisant les indicateurs fluorescents TMRM et H 2 DCF-DA, respectivement. Pour d'autres types cellulaires, il est important de déterminer empiriquement la concentration finale et le temps de chargement pour TMRM ou H 2 DCF-DA. En général, la gamme des concentrations de TMRM 20-200 nm, et le temps d'incubation des cellules avec des TMRM varie de 20 à 60 min. La concentration finale de H 2 DCF-DA varie de 2 à 10 uM, et l'incubation des cellules dans une solution de chargement contenant cet indicateur varie de 30-45 min.
Il est important pour optimiser la puissance du laser et la vitesse de balayage de prendre les images pour éviter à la fois photo-toxicité pour les cellules et les changements dans l'intensité de fluorescence (par exemple vacillante de TMRM fluorescence) en l'absence de tout stimulus. Les paramètres optimisés optiques devrait se traduire par un signal de fluorescence qui n'est pas plus ou moins saturés (seuil) en l'absence de stimulus. Les conditions optimales pour recueillir les images à partir d'un champ sélectionné à un laser de puissance particulière et une vitesse de balayage sont obtenus lorsque il n'ya pas de changements dans l'intensité de fluorescence de la sonde en l'absence de tout stimulus pendant 10-15 min d'imagerie en temps réel.
Autres sondes de fluorescence pour déterminer ΔΨm comprennent la rhodamine 123 et tétra méthyl ester éthylique de la rhodamine (TMRE). Cependant, ils ont été trouvés pour inhiber les processus respiratoires en 2 mitochondries isolées. Surtout, TMRM n'a aucun effet sur la respiration mitochondriale à de faibles concentrations 2 et a phototoxicité faible et photoblanchiment 3 par rapport à d'autres sondes. H 2 DCF-DA est un bon indicateur de ROS comme elle est bien conservée dans les cellules et reconnaît espèces oxydantes de plusieurs, tels que les peroxydes, oxydes super, et l'oxyde nitrique 4.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (K22NS050137 à JCB).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C |
NbActive4 | BrainBits | NbActive4 |
TMRM | Invitrogen | T668 |
H2DCF-DA | Invitrogen | C400 |
NaCl | Sigma | S6191 |
KCl | Sigma | P3911 |
CaCl2•2H2O | Sigma | C3306 |
MgCl2•6H2O | Sigma | M2670 |
D-Glucose | Sigma | G6152 |
HEPES | Invitrogen | 15630 |