Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen

Summary

Tonen we de toepassing van de fluorescentie-indicator, TMRM, in corticale neuronen van de relatieve veranderingen in TMRM fluorescentie-intensiteit te bepalen voor en na toepassing van een specifieke stimulus. We tonen ook de toepassing van de fluorescentie sonde H₂ DCF-DA naar het relatieve niveau van reactieve zuurstof species in corticale neuronen te beoordelen.

Abstract

Mitochondriale membraan potentiaal (ΔΨm) is van cruciaal belang voor het behoud van de fysiologische functie van de luchtwegen keten ATP te genereren. Een significant verlies van ΔΨm maakt cellen uitgeput van energie met daaropvolgende dood. Reactive oxygen species (ROS) zijn belangrijke signaalmoleculen, maar hun accumulatie in pathologische condities leidt tot oxidatieve stress. De twee belangrijkste bronnen van ROS in de cellen zijn milieu-toxines en het proces van oxidatieve fosforylering. Mitochondriale dysfunctie en oxidatieve stress zijn betrokken in de pathofysiologie van vele ziekten, daarom de mogelijkheid om ΔΨm en ROS te bepalen kan belangrijke aanwijzingen over de fysiologische status van de cel en de functie van de mitochondriën.

Verschillende fluorescerende probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) kan gebruikt worden om te bepalen Δψm in een verscheidenheid van celtypes, en vele fluorescentie-indicatoren (Dihydroethidium, dihydrorhodamine 123, H ₂ DCF-DA) kan worden gebruikt om de ROS te bepalen . Bijna alle van de beschikbare fluorescentie probes gebruikt om ΔΨm of ROS te beoordelen zijn single-golflengte indicatoren, die verhogen of verlagen van hun fluorescentie-intensiteit evenredig is aan een stimulus die verhoogt of verlaagt het niveau van ΔΨm of ROS. Zo is het noodzakelijk om de fluorescentie-intensiteit van deze probes te meten op het basisniveau en na de toepassing van een specifieke stimulus. Dit maakt het mogelijk om vast te stellen het percentage van de verandering in de fluorescentie-intensiteit tussen het basisniveau en een stimulans. Deze verandering in de fluorescentie-intensiteit weerspiegelt de verandering in de relatieve niveaus van ΔΨm of ROS. In deze video laten we zien hoe de fluorescentie-indicator, TMRM, toe te passen in de rat corticale neuronen aan de procentuele verandering in TMRM fluorescentie-intensiteit tussen de baseline-niveau en na het toepassen van FCCP, een mitochondriale ontkoppelrail te bepalen. De lagere niveaus van TMRM fluorescentie als gevolg van FCCP behandeling afspiegeling van de depolarisatie van de mitochondriale membraanpotentiaal. We hebben ook laten zien hoe je de fluorescentie sonde H ₂ DCF-DA van toepassing zijn op het niveau van de ROS in corticale neuronen, eerst bij aanvang vervolgens beoordelen en na toepassing van H ₂ O _2. Dit protocol (met kleine wijzigingen) kan ook worden gebruikt om veranderingen in ΔΨm en ROS in verschillende celtypes en in neuronen geïsoleerd van andere hersengebieden te bepalen.

Protocol

1. Celcultuur Corticale neuronen worden geïsoleerd en gekweekt met behulp van eerder beschreven technieken en uitgeplaat op de cultuur gerechten met een glazen bodem (MatTek Corporation, Ashland, MA) bekleed met poly-D-lysine en laminine 1. 2. De voorbereiding van de voorraad-oplossingen voor de fluorescerende probes TMRM en H 2 DCF-DA Bereid een 10-mM voorraad oplossing van TMRM door het oplossen van 5,0 mg TMRM in 1 ml watervrij dimethylsulfoxide. Vortex het voor 1 minuut. Maak dan aliquots en bewaar ze bij -20 ° C, beschermen tegen licht, en het gebruik binnen een maand. Vervolgens bereiden een 10-mM voorraad oplossing van H 2 DCF-DA door het oplossen van 4,87 mg van H 2 DCF-DA in 1 ml watervrij DMSO. Ook vortex het voor 1 minuut. Maak dan aliquots en bewaar ze bij -20 ° C, beschermen tegen licht en gebruik binnen een week. 3. Het laden van rat corticale neuronen met TMRM en H 2 DCF-DA TMRM is een potentiometrische, cel-permeabele fluorescentie-indicator, dat zich ophoopt in de sterk negatief geladen interieur van mitochondriën. Het is belangrijk om de lage concentraties (10-50 nM bereik) van TMRM te gebruiken om auto-quenching van de mitochondriale TMRM te voorkomen. Vervolgens kan de fluorescentie-signaal van TMRM direct verband houden met co-ΔΨm over het binnenste mitochondriale membraan. Een verlies van ΔΨm oorzaken TMRM lekken van mitochondriën leidt tot een verlies van fluorescentie-intensiteit. H 2 DCF-DA is cel-permeabele sonde omgezet in DCF-DA door intracellulaire esterasen, en de oxidatie leidt tot fluorescerende DCF. De uiteindelijke concentratie van H 2 DCF-DA varieert tussen 20 tot 10 uM en het moet empirisch worden getest in neuronen uit verschillende gebieden van de hersenen omdat hoge concentraties van het laden kan resulteren in de verzadiging van de DCF-fluorescentie, zelfs in de afwezigheid van H 2 O 2. De aanwezigheid van een endogene of exogene oxidant (zoals stikstofoxide, waterstof peroxide) zal toenemen DFC fluorescentie-intensiteit. Hieronder geven we een protocol voor het laden van rat corticale neuronen met TMRM en H 2 DCF-DA. Voor het laden van de rat corticale neuronen met TMRM de eerste plaats was de gekweekte neuronen drie keer met buffer Tyrode's (Text Overlay: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl 2, en 10 mM HEPES, de pH instellen op 7,4 met NaOH). Dan, bereiden 20 nM van TMRM door verdunning van de 10 mM TMRM voorraad 1 / 1000 keer in TB en voeg dan 2 pi van de verwaterde TMRM per 1 ml van de TB. Incubeer de neuronen met TMRM gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Na 45 min, monteren de cultuur schotel op het podium van de microscoop en begin beeldvorming. Voor het laden van de rat corticale neuronen met H 2 DCF-DA, was de gekweekte neuronen drie keer met TB. Vervolgens bereiden 2 uM van H 2 DCF-DA door verdunning van de 10 mm H 2 DCF-DA voorraad 1 / 10 keer in TB en voeg dan 2 pl verdund H 2 DCF-DA per 1 ml van de TB. Dan, incubeer de neuronen met H 2 DCF-DA voor 45 min in donker bij kamertemperatuur. Na 45 minuten, was de neuronen vier keer met TB om het overtollige fluorescentie-indicator te verwijderen voordat u om beelden te verkrijgen. 4. Live-beeldvorming van neuronen geïncubeerd met TMRM om te bepalen ΔΨm Voor het uitvoeren van live-beelden van de neuronen geïncubeerd met TMRM, confocale laser scanning microscopie (Text Overlay: LSM 510, Carl Zeiss Inc), met de toepassing van de live-tijd-serie programma, wordt gebruikt. Toe te passen met een lage resolutie en verzwakt laservermogen (Text Overlay: lage resolutie: 256 x 256; laservermogen: 1%) om de tijd die nodig is om beelden te verkrijgen en om te voorkomen dat fotobleking te minimaliseren. . Pas vervolgens de focus van de gemonteerde neuronen geladen met TMRM met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de TMRM fluorescentie door belichting bij 514 nm en detectie bij 570 nm. Stel de detectie te krijgen van een camera net onder het verzadigingsniveau. Zodra alle parameters die resolutie, laservermogen, detectie te krijgen van een camera, en time-lapse-interval zijn te verkrijgen beelden zijn vast te stellen; niet veranderen deze instellingen tussen de experimenten. Vervolgens verandert het veld. Beginnen met het verzamelen beelden. Voor het testen van veranderingen in de ΔΨm, kan stimuli zoals een uM van FCCP of 2 ug / ml van oligomycin, worden toegepast, die aanzienlijk zal depolariseren of hyperpolarize de mitochondriale membraanpotentiaal respectievelijk. Deze wijzigingen zullen worden weerspiegeld door een afname in TMRM fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de baseline fluorescentie-intensiteit in het geval van FCCP, of een toename in TMRM fluorescentie-intensiteit in het geval van oligomycin. 5. Live-beeldvorming van neuronen geïncubeerd met H 2 DCF-DA naar ROS te bepalen Voor het uitvoeren van live-beelden van de neuronen geïncubeerd met H 2 DCF-DA in de eerste, mount de cultuur schotel op het podium van een microscoop. Pas de scherpstelling van de cellen onsING gereflecteerde licht. Onderzoek DCF fluorescentie door excitatie bij 488 nm en emissie bij 515 nm. Daarna pas het laservermogen tot 5-7%, detector te krijgen, en de resolutie van 256 x 256. Niet wijzigen van deze instellingen tussen de experimenten. Stel vervolgens de frequentie voor het verkrijgen van live-beelden met behulp van de tijdreeks programma. Selecteer een nieuw veld en start het verwerven van beelden. Voor het detecteren van veranderingen in de ROS levels, te behandelen cellen met 100 tot 200 uM van H 2 O 2. Dit wordt weergegeven door een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van baseline-niveau. 6. Data-analyse Gebruik region of interest (Text Overlay: ROI) gereedschap uit de LSM-programma om de gebieden te selecteren. Dan, het meten van de TMRM of ROS fluorescentie-intensiteiten. Selecteer de ROI van mitochondriaal regio's of ROI's uit de hele cel lichaam in beeld gebracht cellen om de fluorescentie-intensiteit van TMRM of ROS, respectievelijk te meten. Bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van alle ROI van elke cel voor TMRM of van whole cell instanties voor alle belichte cellen voor ROS voor elk tijdstip. Selecteer de regio naast de cellen naar de achtergrond fluorescentie-intensiteit te berekenen. Enkele metingen uit en bereken het gemiddelde achtergrond intensiteit. Trek de gemiddelde achtergrond fluorescentie-intensiteit van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de ROI in elke cel van elk tijdstip met behulp van Microsoft Excel. Na aftrek van achtergrond intensiteit, normaliseren de TMRM of DCF fluorescentie-intensiteit van de baseline fluorescentie met deze formule (Text Overlay: AF = FF o / F o x 100, waarbij F = fluorescentie-intensiteit op elk tijdstip, Voor = baseline fluorescentie). Gebruik dan de Sigma Plot programma om het perceel waarop de veranderingen in fluorescentie-intensiteit in de tijd te genereren. 7. Representatieve resultaten Figuur 1A toont een beeld van de fluorescentie rat corticale neuronen geïncubeerd met TMRM. Toevoeging van FCCP, een mitochondriale ontkoppelrail, leidt tot mitochondriale depolarisatie en een verlies van TMRM fluorescentie-intensiteit (Fig. 1B). De baseline TMRM fluorescentie niveau blijft stabiel voor toevoeging van FCCP (de eerste 350 seconden;. Figuur 1C). Kwantitatieve analyse van TMRM fluorescentie verandert in de tijd toont een significante afname in TMRM fluorescentie na toevoeging van FCCP (Fig. 1C). Figuur 1D toont de fluorescentie beeld van de rat corticale neuronen geladen met DCF. Toevoeging van H 2 O 2 resulteert in een verhoogde DCF fluorescentie-intensiteit in cel organen (fig. 1E). De baseline DCF fluorescentie niveau is ongewijzigd (de eerste 120 sec) vóór de toepassing van H 2 O 2. Time-lapse metingen van DCF fluorescentie geven aan haar vaste niveaus, die toenemen na H 2 O 2 behandeling (fig. 1F). Figuur 1. Beoordeling van de mitochondriale membraanpotentiaal en ROS levels in levende rat corticale neuronen. (A) Vertegenwoordiger fluorescentie beeld van de corticale neuronen geladen met TMRM. Na het scannen van de baseline TMRM fluorescentie, werden behandeld met de neuronen protonophore FCCP (1 uM). Aan de rechterkant is een pseudokleur intensiteit bar van TMRM fluorescentie met fel geel en zwart die maximum en minimum intensiteit, respectievelijk. Het verlies van TMRM fluorescentie van de mitochondriale regio's geeft de ineenstorting van ΔΨm op FCCP behandeling (panel B). De kwantitatieve vertegenwoordiging van verandering in TMRM fluorescentie-intensiteit op verschillende tijdstippen voor en na FCCP behandeling wordt getoond in paneel C. (D) Fluorescentie beeld van de rat corticale neuronen geladen met H2DCF-DA. Na het bepalen van de baseline DCF fluorescentie, werden de cellen behandeld met 200 uM H 2 O 2, en de verandering in de DCF fluorescentie werd beoordeeld. Een toename van de DCF fluorescentie weerspiegelt de toename van de ROS levels bij H 2 O 2 behandeling (E). Kwantitatieve analyse van verandering in de DCF fluorescentie, voor en na de H 2 O 2 de behandeling, wordt weergegeven in paneel F. Schaal bar = 10 urn Video.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi Live-cell imaging van TMRM in corticale neuronen voor en na FCCP Naast het gebruik van 40X doelstelling. De pseudocolor intensiteit toont een maximum (fel geel, voor FCCP toevoeging) en verminderde (rode kleur, na FCCP toevoeging) TMRM fluorescentie-intensiteit na FCCP toevoeging. Klik hier om de video te bekijken Video. 7.5 – labmedia 2704_Joshi.avi Live-cell imaging van de DCF in corticale neuronen voor en na H 2 O 2 Naast het gebruik van 40X doelstelling. De baseline DCF fluorescentie heeft lichtgroene kleur in cel organen en H2O2 Daarnaast verhoogt de DCF fluorescentie-intensiteit te felle groene kleur. Klik hier om video te bekijken

Discussion

We hebben gepresenteerd een stap-voor-stap procedure beschrijft hoe u ΔΨm en ROS bepalen rat corticale neuronen met behulp van de TL-indicatoren TMRM en H ₂ DCF-DA, respectievelijk. Voor andere celtypen, is het belangrijk om empirisch vast te stellen is de uiteindelijke concentratie en laden tijd voor TMRM of H ₂ DCF-DA. In het algemeen, TMRM concentraties range 20 tot 200 nM, en de cel incubatie tijd met TMRM varieert van 20 tot 60 minuten. De uiteindelijke concentratie van H ₂ DCF-DA varieert 2-10 uM, en incubatie van cellen in een laad-oplossing die deze indicator varieert van 30-45 min..

Het is belangrijk om het optimaliseren van de laser kracht en de scansnelheid van het nemen van de beelden, zowel voor foto-toxiciteit te vermijden om de cellen en veranderingen in de fluorescentie-intensiteit (bijvoorbeeld flikkeren van TMRM fluorescentie) in het ontbreken van een stimulus. De geoptimaliseerde optische instellingen moeten resulteren in een fluorescentie-signaal dat is niet meer of minder verzadigd (drempel) in de afwezigheid van de stimulus. De optimale voorwaarden om de beelden te verzamelen van een geselecteerd veld op een bepaalde laservermogen en een scansnelheid worden bereikt als er geen veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de sonde in het ontbreken van een stimulans voor 10-15 minuten van de live imaging.

Andere fluorescentie probes aan ΔΨm bepalen onder meer rhodamine 123 en tetra-methyl-rhodamine ethylester (TMRE). Ze werden echter gevonden om de respiratoire processen in geïsoleerde mitochondria ² remmen. Belangrijk is dat TMRM heeft geen effect op de mitochondriale ademhaling bij lage concentraties ² en heeft een lage fototoxiciteit en fotobleking ³ in vergelijking met andere sondes. H ₂ DCF-DA is een goede indicator voor de ROS als het is goed bewaard in de cellen en herkent verschillende oxidant soorten, zoals peroxiden, super oxiden, en stikstofoxide ^4.

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
NbActive4	BrainBits	NbActive4
TMRM	Invitrogen	T668
H2DCF-DA	Invitrogen	C400
NaCl	Sigma	S6191
KCl	Sigma	P3911
CaCl2•2H2O	Sigma	C3306
MgCl2•6H2O	Sigma	M2670
D-Glucose	Sigma	G6152
HEPES	Invitrogen	15630