Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Summary

Nós demonstramos a aplicação do indicador de fluorescência, TMRM, em neurônios corticais para determinar a alterações relativas na intensidade de fluorescência TMRM antes e após a aplicação de um estímulo específico. Mostramos também a aplicação da sonda de fluorescência H₂ DCF-DA para avaliar o nível relativo de espécies reativas de oxigênio nos neurônios corticais.

Abstract

Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) é fundamental para manter a função fisiológica da cadeia respiratória para gerar ATP. A perda significativa de células ΔΨm torna esgotado de energia, com posterior morte. Espécies reativas de oxigênio (ROS) são importantes moléculas sinalizadoras, mas a sua acumulação em condições patológicas leva ao estresse oxidativo. As duas principais fontes de ROS nas células são toxinas ambientais e do processo de fosforilação oxidativa. Disfunção mitocondrial eo estresse oxidativo têm sido implicados na fisiopatologia de muitas doenças e, portanto, a capacidade de determinar ΔΨm e ROS pode fornecer pistas importantes sobre o estado fisiológico da célula ea função das mitocôndrias.

Várias sondas fluorescentes (Rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1) pode ser usado para determinar Δψm em uma variedade de tipos celulares, e muitos indicadores de fluorescência (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H ₂ DCF-DA) pode ser usado para determinar ROS . Quase todas as sondas de fluorescência disponíveis utilizados para avaliar ΔΨm ou ROS são um único comprimento de onda de indicadores, que aumentar ou diminuir sua intensidade de fluorescência proporcional a um estímulo que aumenta ou diminui os níveis de ΔΨm ou ROS. Assim, é imperativo para medir a intensidade de fluorescência destas sondas ao nível basal e após a aplicação de um estímulo específico. Isto permite uma para determinar a porcentagem de mudança na intensidade de fluorescência entre o nível de referência e um estímulo. Esta mudança na intensidade da fluorescência reflete a mudança nos níveis relativos de ΔΨm ou ROS. Neste vídeo, demonstramos como aplicar o indicador de fluorescência, TMRM, em neurônios corticais de ratos para determinar a variação percentual na intensidade de fluorescência TMRM entre o nível de base e após a aplicação de FCCP, um desacoplador mitocondrial. Os níveis mais baixos de TMRM fluorescência resultante do tratamento FCCP refletem a despolarização do potencial de membrana mitocondrial. Também mostramos como aplicar a fluorescência da sonda H _2-DA DCF para avaliar o nível de ROS em neurônios corticais, primeiro na linha de base e, em seguida, após a aplicação de H ₂ O _2. Este protocolo (com pequenas modificações) também podem ser usados ​​para determinar mudanças no ΔΨm e ROS em diferentes tipos celulares e em neurônios isolados de outras regiões do cérebro.

Protocol

1. Cultura de células Neurônios corticais estão isolados e cultivados com técnicas previamente descritas e semeadas em placas de cultura com um fundo de vidro (Mattek Corporation, Ashland, MA) revestidas com poli-D-lisina e laminina 1. 2. Preparação das soluções estoque para o fluorescente sondas TMRM e 2 H DCF-DA Prepare uma solução estoque de 10 mM de TMRM pela dissolução de 5,0 mg de TMRM em 1 ml de dimetilsulfóxido anidro. Vortex por 1 min. Então, faça alíquotas e armazená-los a -20 ° C, proteger da luz, e usar dentro de um mês. Em seguida, preparar uma solução estoque de 10 mM de H 2 DCF-DA dissolvendo 4,87 mg de H 2 DCF-DA em 1 ml de DMSO anidro. Da mesma forma vortex, por 1 min. Então, faça alíquotas e armazená-los a -20 ° C, proteger da luz, e usar dentro de uma semana. 3. Carregando neurônios de rato cortical com TMRM e 2 H DCF-DA TMRM é um potenciométrica, indicador de célula-permeável fluorescentes que se acumula no interior altamente carregadas negativamente das mitocôndrias. É importante usar a baixas concentrações (10-50 nm) de TMRM para evitar a auto-extinção da TMRM mitocondrial. Então, o sinal de fluorescência de TMRM pode ser diretamente co-relacionados com a ΔΨm através da membrana mitocondrial interna. A perda de ΔΨm causas TMRM a fuga de mitocôndrias, resultando em uma perda de intensidade de fluorescência. H 2 DCF-DA é a célula-permeável sonda convertido em DCF-DA por esterases intracelulares, e os resultados a sua oxidação no DCF fluorescente. A concentração final de H 2 DCF-DA varia entre 2-10 mM e deve ser testado empiricamente em neurônios derivados de diferentes regiões do cérebro vez que a concentração de carga elevada pode resultar na saturação de fluorescência DCF, mesmo na ausência de H 2 O 2. A presença de qualquer oxidante endógeno ou exógeno (por exemplo, óxido nítrico, peróxido de hidrogênio) aumentará DFC intensidade de fluorescência. Abaixo, fornecemos um protocolo para o carregamento com neurônios de rato cortical TMRM e 2 H DCF-DA. Para carregar os neurônios de rato cortical com TMRM, primeiro, lave os neurônios cultivados 3 vezes com tampão Tyrode do (Overlay Texto: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e 10 HEPES mM; ajustar o pH para 7,4 com NaOH). Então, prepare 20 nM de TMRM diluindo a 10 mM de ações TMRM 1 / 1000 vezes em TB e depois adicionar 2 l da TMRM diluído por 1 ml de TB. Incubar os neurônios com TMRM por 45 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após 45 min, monte o prato de cultura no palco do microscópio e começar de imagem. Para carregar os neurônios de rato cortical com H 2 DCF-DA, lave os neurônios cultivados 3 vezes com TB. Em seguida, prepare 2 mM de H 2 DCF-DA diluindo a 10 mM H 2 DCF-DA estoque 10/01 vezes em TB e depois adicionar 2 l da diluição H 2 DCF-DA por 1 ml de TB. Então, incubar os neurônios com H 2 DCF-DA por 45 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após 45 min, lave os neurônios 4 vezes com TB para remover indicador fluorescente excesso antes de obter imagens. 4. Ao vivo imagens de neurônios incubadas com TMRM para determinar ΔΨm Para realizar imagens ao vivo de neurônios incubadas com TMRM, microscopia confocal de varredura a laser (Overlay Texto: LSM 510, Carl Zeiss Inc.), com a aplicação do programa de séries temporais ao vivo, é usado. Aplicar de baixa resolução e atenuada a laser de potência (Overlay Texto: baixa resolução: 256 x 256; potência do laser: 1%) para minimizar o tempo necessário para obter imagens e evitar fotodegradação. . Em seguida, ajustar o foco dos neurônios montado carregado com TMRM usando luz refletida. Examine a fluorescência TMRM pela iluminação a 514 nm e detecção a 570 nm. Definir o ganho de detecção de uma câmera, logo abaixo do nível de saturação. Uma vez que todos os parâmetros que incluem resolução, potência do laser, o ganho de detecção de uma câmera, e lapso de tempo de intervalo para obter imagens são definidas, não alterar essas configurações entre experimentos. Em seguida, altere o campo. Começar a recolher imagens. Para testar as alterações no ΔΨm, estímulos como uma mM de FCCP ou 2 mg / ml de oligomicina, pode ser aplicado, de forma significativa ou despolarizar hiperpolarizar o potencial de membrana mitocondrial, respectivamente. Estas alterações serão refletidas por uma diminuição na intensidade de fluorescência TMRM comparada com a intensidade de fluorescência de base, no caso de FCCP, ou um aumento na intensidade de fluorescência TMRM no caso de oligomicina. 5. Imagens ao vivo de neurônios incubadas com H 2 DCF-DA para determinar ROS Para realizar imagens ao vivo de neurônios incubadas com H 2 DCF-DA, primeiro, montar a placa de cultura no palco de um microscópio. Ajustar o foco das células-nosing luz refletida. Examine DCF fluorescência por excitação a 488 nm e emissão a 515 nm. Em seguida, ajuste a potência do laser para 5-7%, o ganho do detector, e resolução de 256 x 256. Não altere estas configurações entre experimentos. Em seguida, defina a freqüência para a obtenção de imagens ao vivo usando o programa de séries temporais. Selecione um campo novo e começar a adquirir as imagens. Para detectar mudanças nos níveis de ROS, tratar células com 100-200 mM de H 2 O 2. Isso será refletido por um aumento na intensidade de fluorescência DCF em comparação com o nível basal. 6. Análise de dados Use região de interesse (Overlay Texto: ROI) ferramenta do programa de LSM para selecionar as áreas. Então, medir o TMRM ou ROS intensidades de fluorescência. Selecione ROIs de regiões mitocondriais ou ROIs do corpo celular em células de toda fotografada para medir a intensidade de fluorescência de TMRM ou ROS, respectivamente. Calcular a intensidade média de fluorescência de todos os ROIs de cada célula para TMRM ou de corpos de células inteiras para todas as células com imagens de ROS para cada ponto de tempo. Selecione regiões próximas às células para calcular a intensidade de fluorescência de fundo. Tomar várias medidas e calcular a intensidade média de fundo. Subtrair a intensidade de fluorescência média de fundo de média intensidades de fluorescência das ROIs em cada célula para cada ponto de tempo usando o Microsoft Excel. Depois de subtrair a intensidade de fundo, normalizar a intensidade TMRM ou DCF fluorescência para a fluorescência de base usando esta fórmula (Overlay Texto: ΔF = FF o / F o x 100, onde F = intensidade de fluorescência em qualquer ponto do tempo, Para = linha de base de fluorescência). Então, use o programa Sigma Plot para gerar o gráfico mostrando as mudanças na intensidade de fluorescência ao longo do tempo. 7. Resultados representante Figura 1A mostra uma imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato incubadas com TMRM. Adição de FCCP, um desacoplador mitocondrial, leva a despolarização mitocondrial e uma perda de TMRM intensidade de fluorescência (Figura 1B). A linha de base nível de fluorescência TMRM permanece estável antes da adição de FCCP (o primeiro 350 seg;. Fig 1C). Análise quantitativa de fluorescência TMRM mudanças ao longo do tempo mostra uma diminuição significativa na fluorescência TMRM após a adição de FCCP (Fig. 1C). Figura 1D mostra a imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato carregado com DCF. Adição de H 2 O 2 resulta em aumento da intensidade de fluorescência DCF nos corpos celulares (Fig. 1E). A linha de base DCF nível de fluorescência mantém-se inalterado (os primeiros 120 segundos) antes da aplicação de H 2 O 2. Lapso de tempo de medições de fluorescência DCF mostram seus níveis estáveis, o que aumenta depois de H 2 O 2 de tratamento (Fig. 1F). Figura 1. Avaliação do potencial de membrana mitocondrial e os níveis de ROS em neurônios corticais rato vivo. (A) Representante imagem de fluorescência de neurônios corticais carregado com TMRM. Após a digitalização da linha de base TMRM de fluorescência, os neurônios foram tratados com o FCCP protonophore (1 mM). Para a direita é um bar pseudo intensidade de fluorescência TMRM com o máximo de amarelo e preto brilhante representação e intensidade mínima, respectivamente. A perda de fluorescência TMRM das regiões mitocondrial indica o colapso do ΔΨm sobre FCCP tratamento (painel B). A representação quantitativa da mudança na intensidade de fluorescência TMRM em momentos diferentes, antes e após o tratamento FCCP é mostrado no painel C. (D) a imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato carregado com H2DCF-DA. Após a determinação da linha de base DCF fluorescência, as células foram tratadas com 200 mM H 2 O 2, ea mudança no DCF fluorescência foi avaliada. Um aumento na fluorescência do DCF reflete o aumento nos níveis de ROS em H 2 O 2 tratamento (E). Análise quantitativa das mudanças no DCF fluorescência, antes e depois do H 2 O 2 tratamento, é mostrado no painel da barra de escala F. = 10 mM Video.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi Ao vivo imagens de células de TMRM em neurônios corticais antes e depois disso FCCP utilizando objetiva de 40X. A intensidade mostra um pseudo (amarelo brilhante, antes da adição FCCP) e diminuição máxima (cor vermelha, após a adição FCCP) TMRM intensidade de fluorescência após a adição FCCP. Clique aqui para ver o vídeo Vídeo. 7.5 – labmedia 2704_Joshi.avi Ao vivo imagens de células de DCF nos neurônios corticais antes e depois do H 2 O 2 disso utilizando objetiva de 40X. A linha de base DCF fluorescência tem cor verde-claro nos corpos celulares e H2O2 disso aumenta o DCF intensidade de fluorescência de cor verde brilhante. Clique aqui para ver o vídeo

Discussion

Nós apresentamos um procedimento passo-a-passo descreve como determinar ΔΨm e ROS em neurônios corticais de rato usando o fluorescente indicadores TMRM e H ₂ DCF-DA, respectivamente. Para outros tipos de células, é importante determinar empiricamente a concentração final e tempo de carregamento para TMRM ou ₂ H DCF-DA. Em geral, as concentrações de gama TMRM 2-20 nM, eo tempo de incubação das células com TMRM varia de 20 a 60 min. A concentração final de H ₂ DCF-DA faixas de 2-10 mM, e incubação de células em uma solução de carga contendo este indicador varia de 30-45 min.

É importante para otimizar a potência do laser e velocidade de digitalização de levar as imagens para evitar a foto-toxicidade para as células e as mudanças na intensidade de fluorescência (por exemplo cintilação de TMRM fluorescência), na ausência de qualquer estímulo. As configurações otimizadas óptico deve resultar em um sinal de fluorescência que não está acima ou abaixo saturadas (threshold) na ausência de estímulo. As condições ideais para coletar as imagens de um campo selecionado em uma potência do laser em particular e uma velocidade de digitalização são obtidas quando não há mudanças na intensidade de fluorescência da sonda na ausência de qualquer estímulo por 10-15 min de imagens ao vivo.

Outras sondas de fluorescência para determinar ΔΨm incluem rodamina 123 e tetra metil etil éster rodamina (TMRE). No entanto, eles foram encontrados para inibir os processos respiratórios em ^dois mitocôndrias isoladas. Importante, TMRM não tem nenhum efeito sobre a respiração mitocondrial em baixas concentrações ² e tem fototoxicidade baixa e fotobranqueamento ^{3, em} comparação com outras sondas. H ₂ DCF-DA é um bom indicador para ROS como é bem retida nas células e reconhece as espécies oxidantes diversos, tais como peróxidos, óxidos de super, e óxido nítrico ^4.

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
NbActive4	BrainBits	NbActive4
TMRM	Invitrogen	T668
H2DCF-DA	Invitrogen	C400
NaCl	Sigma	S6191
KCl	Sigma	P3911
CaCl2•2H2O	Sigma	C3306
MgCl2•6H2O	Sigma	M2670
D-Glucose	Sigma	G6152
HEPES	Invitrogen	15630