Dimostriamo applicazione del indicatore di fluorescenza, TMRM, nei neuroni corticali per determinare le variazioni relative a TMRM intensità di fluorescenza, prima e dopo l'applicazione di uno stimolo specifico. Mostriamo anche l'applicazione della sonda di fluorescenza H<sub> 2</sub> DCF-DA per valutare il livello relativo di specie reattive dell'ossigeno nei neuroni corticali.
Potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) è fondamentale per il mantenimento della funzione fisiologica della catena respiratoria per generare ATP. Una perdita significativa di cellule ΔΨm rende impoverito di energia con conseguente morte. Specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono importanti molecole di segnalazione, ma il loro accumulo in condizioni patologiche porta allo stress ossidativo. Le due principali fonti di ROS nelle cellule sono tossine ambientali e il processo di fosforilazione ossidativa. Disfunzione mitocondriale e lo stress ossidativo sono stati coinvolti nella fisiopatologia di molte malattie, quindi, la possibilità di determinare ΔΨm ROS e può fornire indizi importanti circa lo stato fisiologico della cellula e la funzione dei mitocondri.
Diverse sonde fluorescenti (rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1) può essere utilizzato per determinare Δψm in una varietà di tipi di cellule, e molti indicatori di fluorescenza (Dihydroethidium, diidrorodamina 123, H 2 DCF-DA) può essere usato per determinare ROS . Quasi tutte le sonde a fluorescenza a disposizione per valutare ΔΨm o ROS sono singola lunghezza d'onda indicatori, che aumentano o diminuiscono la loro intensità di fluorescenza proporzionale a uno stimolo che aumenta o diminuisce i livelli di ΔΨm o ROS. Quindi, è indispensabile per misurare l'intensità di fluorescenza di queste sonde a livello basale e dopo l'applicazione di uno stimolo specifico. Questo permette di determinare la percentuale di variazione di intensità di fluorescenza tra il livello base e uno stimolo. Questo cambiamento di intensità di fluorescenza riflette la variazione dei livelli relativi di ΔΨm o ROS. In questo video ci dimostra come applicare l'indicatore di fluorescenza, TMRM, in neuroni corticali di ratto per determinare la variazione percentuale TMRM intensità di fluorescenza tra il livello basale e dopo l'applicazione FCCP, un disaccoppiatore mitocondriale. I livelli più bassi di TMRM fluorescenza risultante dal trattamento FCCP riflettono la depolarizzazione del potenziale della membrana mitocondriale. Mostriamo anche come applicare la fluorescenza della sonda H 2 DCF-DA per valutare il livello di ROS in neuroni corticali, prima in condizioni basali e dopo l'applicazione di H 2 O 2. Questo protocollo (con piccole modifiche) può essere utilizzato anche per determinare le variazioni ΔΨm e ROS in diversi tipi di cellule e nei neuroni isolati da altre regioni del cervello.
Abbiamo presentato un passo-passo procedura che descrive come determinare ΔΨm e ROS in neuroni corticali di ratto utilizzando la fluorescenza indicatori TMRM e H 2 DCF-DA, rispettivamente. Per altri tipi di cellule, è importante per determinare empiricamente la concentrazione finale e il tempo di caricamento per TMRM o H 2 DCF-DA. In generale, la gamma TMRM concentrazioni di 20-200 nM, e il tempo di incubazione delle cellule con TMRM varia da 20 a 60 min. La concentrazione finale di H 2 DCF-DA range 2-10 mM, e l'incubazione di cellule in soluzione tampone contenente tale indicatore varia da 30-45 min.
E 'importante per ottimizzare la potenza del laser e velocità di scansione di prendere le immagini per evitare sia foto-tossicità per le cellule e le variazioni dell'intensità di fluorescenza (ad esempio lo sfarfallio di TMRM fluorescenza), in assenza di qualsiasi stimolo. Le impostazioni ottimizzate ottico dovrebbe sfociare in un segnale di fluorescenza che non è sopra o sotto saturi (soglia) in assenza di stimolo. Le condizioni ottimali per raccogliere le immagini da un campo selezionato in una potenza del laser particolare e una velocità di scansione si ottengono quando non ci sono cambiamenti nella intensità di fluorescenza della sonda, in assenza di qualsiasi stimolo per 10-15 minuti di immagini dal vivo.
Altre sonde a fluorescenza per determinare ΔΨm comprendono rodamina 123 e tetra metilico rodamina etile (TMRE). Tuttavia, essi sono stati trovati per inibire i processi respiratori nella isolata 2 mitocondri. Importante, TMRM non ha alcun effetto sulla respirazione mitocondriale a basse concentrazioni 2 e ha fototossicità bassa e photobleaching 3 rispetto con altre sonde. H 2 DCF-DA è un buon indicatore di ROS, come è ben conservato nelle cellule e riconosce diverse specie ossidanti, come i perossidi, ossidi super, e l'ossido nitrico 4.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (K22NS050137 a JCB).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C |
NbActive4 | BrainBits | NbActive4 |
TMRM | Invitrogen | T668 |
H2DCF-DA | Invitrogen | C400 |
NaCl | Sigma | S6191 |
KCl | Sigma | P3911 |
CaCl2•2H2O | Sigma | C3306 |
MgCl2•6H2O | Sigma | M2670 |
D-Glucose | Sigma | G6152 |
HEPES | Invitrogen | 15630 |