Wir demonstrieren die Anwendung der Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in kortikalen Neuronen, die relativen Veränderungen in TMRM Fluoreszenzintensität vor und nach der Anwendung eines bestimmten Stimulus zu bestimmen. Wir zeigen auch die Anwendung der Fluoreszenz-Sonde H<sub> 2</sub> DCF-DA auf die relative Höhe der reaktiven Sauerstoffspezies in kortikalen Neuronen zu beurteilen.
Mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktion der Atmungskette zur ATP zu generieren. Ein signifikanter Verlust von ΔΨm macht Zellen von Energie mit anschließender Tod erschöpft. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind wichtige Signalmoleküle, aber ihre Häufung in pathologischen Zuständen führt zu oxidativem Stress. Die beiden wichtigsten Quellen von ROS in der Zelle sind Umweltgifte und den Prozess der oxidativen Phosphorylierung. Mitochondriale Dysfunktion und oxidativer Stress in der Pathophysiologie vieler Krankheiten in Verbindung gebracht, daher die Fähigkeit, ΔΨm und ROS bestimmen kann wichtige Hinweise über die physiologischen Zustand der Zelle und die Funktion der Mitochondrien liefern.
Mehrere Fluoreszenzsonden (Rhodamin 123, TMRM, TMRE, JC-1) kann verwendet werden, um Δψm in einer Vielzahl von Zelltypen zu bestimmen, und viele Fluoreszenz-Indikatoren (Dihydroethidium, Dihydrorhodamin 123, H 2 DCF-DA) kann verwendet werden, um ROS bestimmen . Fast alle der verfügbaren Fluoreszenz-Sonden verwendet werden, um ΔΨm oder ROS beurteilen einzigen Wellenlänge Indikatoren, die erhöhen oder verringern ihre Fluoreszenzintensität proportional auf einen Stimulus, erhöht oder verringert die Höhe der ΔΨm oder ROS. So ist es unerlässlich, die Fluoreszenz-Intensität dieser Sonden an der Grundlinie auf und nach der Anwendung eines spezifischen Reiz zu messen. Dies erlaubt es, den Prozentsatz der Änderung in der Fluoreszenzintensität zwischen der Grundlinie Ebene und einen Stimulus zu bestimmen. Diese Änderung in der Fluoreszenz-Intensität spiegelt die Veränderung der relativen Werte von ΔΨm oder ROS. In diesem Video zeigen wir, wie die Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in Ratte kortikalen Neuronen beziehen sich auf die prozentuale Veränderung in TMRM Fluoreszenzintensität zwischen der Grundlinie auf und nach der Anwendung FCCP, eines mitochondrialen Entkoppler zu bestimmen. Die unteren Ebenen der TMRM Fluoreszenz aus FCCP Behandlung spiegeln die Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials. Wir zeigen auch, wie die Fluoreszenz-Sonde H 2 DCF-DA beziehen sich auf die Ebene von ROS in kortikalen Neuronen, zuerst an der Basislinie zu beurteilen und dann nach der Anwendung von H 2 O 2. Dieses Protokoll (mit kleinen Änderungen) kann auch verwendet werden, um Änderungen in ΔΨm und ROS in verschiedenen Zelltypen und in Neuronen von anderen Hirnregionen isoliert zu bestimmen.
Wir haben eine Schritt-für-Schritt-Verfahren beschreiben, wie ΔΨm und ROS in Ratte kortikalen Neuronen mit dem fluoreszierenden Indikatoren TMRM und H 2 DCF-DA, bzw. festzustellen, vorgestellt. Für andere Zelltypen, ist es wichtig, empirisch bestimmt die endgültige Konzentration und Ladezeit für TMRM oder H 2 DCF-DA. Im Allgemeinen TMRM Konzentrationen liegen im Bereich von 20 bis 200 nM, und die Zelle Inkubationszeit mit TMRM variiert von 20 bis 60 min. Die Endkonzentration von H 2 DCF-DA reicht von 2-10 um, und die Inkubation von Zellen in einem Laden-Lösung mit diesem Indikator variiert von 30 bis 45 min.
Es ist wichtig, die Laserleistung und Scan-Geschwindigkeit von unter die Bilder, um sowohl photo-Toxizität für die Zellen und Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (z. B. Flackern TMRM Fluoreszenz) in Ermangelung einer Stimulus zu vermeiden optimieren. Das optimierte optische Einstellungen sollten in einem Fluoreszenz-Signal, das nicht über oder unter gesättigten (Schwelle) in Abwesenheit des Stimulus führen. Die optimalen Bedingungen, um die Bilder aus einem ausgewählten Feld an einer bestimmten Laserleistung und eine Scan-Geschwindigkeit sammeln werden erzielt, wenn es keine Änderungen in der Fluoreszenz-Intensität der Sonde in das Fehlen jeglicher Anreiz für 10-15 min von Live-Bildgebung.
Andere Fluoreszenz-Sonden an ΔΨm bestimmen, sind Rhodamin 123 und Tetra methyl Rhodamin Ethylester (TMRE). Allerdings waren sie zu finden, um die Atemwege Prozesse in isolierten Mitochondrien 2 hemmen. Wichtig ist, dass TMRM keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung bei niedrigen Konzentrationen 2 und hat einen geringen Phototoxizität und Ausbleichen 3 im Vergleich mit anderen Sonden. H 2 DCF-DA ist ein guter Indikator für ROS, wie sie ist gut in den Zellen erhalten und erkennt verschiedene Oxidantien, wie Peroxide, Superoxide und Salpetersäure Oxid 4.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (K22NS050137 zu JCB) unterstützt.
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C |
NbActive4 | BrainBits | NbActive4 |
TMRM | Invitrogen | T668 |
H2DCF-DA | Invitrogen | C400 |
NaCl | Sigma | S6191 |
KCl | Sigma | P3911 |
CaCl2•2H2O | Sigma | C3306 |
MgCl2•6H2O | Sigma | M2670 |
D-Glucose | Sigma | G6152 |
HEPES | Invitrogen | 15630 |