우리는 특정 자극의 응용 프로그램을 이전과 이후 TMRM 형광 강도의 상대적 변화를 결정하기 위해 대뇌 피질의 뉴런에서, 형광 표시기, TMRM의 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 또한 형광 프로브 H의 응용 프로그램을 표시<sub> 2</sub> DCF – DA 대뇌 피질의 뉴런의 반응 산소 종의 상대적 수준을 평가합니다.
Mitochondrial 막 잠재적인 (ΔΨm)는 ATP를 생성하는 호흡 체인의 생리 기능을 유지하기위한 중요합니다. ΔΨm의 큰 손실이 이후의 죽음과 에너지의 고갈 세포를 렌더링. 반응 산소 종 (ROS)는 중요한 신호 분자 있지만, 병적인 조건에서 그들의 축적은 산화 스트레스로 연결됩니다. 세포에 ROS의 두 가지 주요 소스는 환경 독소 및 산화 인산화 과정입니다. Mitochondrial 장애 및 산화 스트레스는 많은 질병의 pathophysiology에 연루되어있다, 그러므로 ΔΨm 및 ROS를 결정하는 능력은 세포와 mitochondria의 기능의 생리적 상태에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습니다.
여러 형광 프로브 (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC – 1) 세포 유형의 다양한 Δψm을 결정하는 데 사용, 그리고 수 많은 형광 지표 (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF – DA)는 ROS를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 . 거의 ΔΨm 또는 ROS를 평가하는 데 사용 가능한 형광 프로브의 모든 ΔΨm이나 ROS의 수준을 증가 또는 감소 자극에 비례 자신의 형광 강도를 증가 또는 감소 단일 파장 지표입니다. 따라서, 그것은 기본 수준과 특정 자극의 적용 후 이러한 프로브의 형광 강도를 측정하는 필수적입니다. 이것은 하나가 기본 수준과 자극 사이의 형광 강도의 변화의 비율을 결정할 수 있습니다. 형광 강도이 변경 사항은 ΔΨm이나 ROS의 상대적인 수준의 변화를 반영합니다. 이 비디오에서는, 우리는 기본 수준 사이 FCCP, mitochondrial uncoupler를 적용한 후에 TMRM 형광 강도의 비율 변화를 확인하기 위해 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 형광 표시기, TMRM을 적용하는 방법을 보여줍니다. FCCP 치료 인한 TMRM 형광의 낮은 수준 mitochondrial 막 잠재력의 탈분극을 반영합니다. 우리는 또한 H 2 O 2의 신청 후에베이스 라인 처음에 대뇌 피질의 뉴런에서 ROS의 수준을 평가하고 형광 프로브 H 2 DCF – DA를 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 (작은 수정)도 다른 세포 유형과 다른 뇌 영역에서 분리된 뉴런에 ΔΨm 및 ROS의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 각각 형광 표시기 TMRM와 H 2 DCF – DA를 사용하여 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에 ΔΨm과 ROS를 결정하는 방법을 설명하는 단계별 절차를 제공합니다. 다른 세포 유형에 대한, 경험적으로 TMRM 또는 H 2 DCF – DA의 최종 농도 및 로딩 시간을 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 TMRM 20-200 NM의 농도 범위, 그리고 TMRM과 세포 배양 시간은 20 60 분 다릅니다. H 2의 최종 농도는 DCF – DA는 20-10 μm의 범위에서,이 표시기를 포함하는로드 솔루션 세포의 배양은 30-45 분부터 다릅니다.
어떤 자극이없는에있는 세포 및 형광 강도의 변화 (TMRM 형광 깜빡 예를 들어)을 모두 사진 독성을 피하기 위해 이미지를 복용의 레이저 전원 및 스캔 속도를 최적화하는 것이 중요합니다. 최적화된 광학 설정은 자극의 부재에서 (요건) 포화 이상 또는 이하가 아닌 형광 신호를 발생한다. 라이브 영상을 10-15 분에 대한 자극의 부재에서 프로브의 형광 강도에 변화가없는 경우 특정 레이저 파워와 스캔 속도로 선택한 필드에서 이미지를 수집하기 위해 최적의 조건을 달성하고 있습니다.
ΔΨm을 결정하기 위해 다른 형광 프로브는 rhodamine 123와 테트라 메틸 에틸 에스테르 rhodamine (TMRE)를 포함합니다. 그러나, 그들은 고립 mitochondria 2의 호흡 과정을 억제하는 것으로 확인되었습니다. 중요한 TMRM 낮은 농도 2 mitochondrial 호흡에 영향을주지 않습니다 낮은 phototoxicity 및 기타 프로브에 비해 3 photobleaching 있습니다. H 2 DCF – DA는 잘 세포의 유지와 같이 ROS에 대한 좋은 지표 등 peroxides 같은 여러 산화제 종, 슈퍼 산화물과 질산 산화물 4 인식합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 보건원 (JCB에 K22NS050137)에 의해 지원되었다.
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C |
NbActive4 | BrainBits | NbActive4 |
TMRM | Invitrogen | T668 |
H2DCF-DA | Invitrogen | C400 |
NaCl | Sigma | S6191 |
KCl | Sigma | P3911 |
CaCl2•2H2O | Sigma | C3306 |
MgCl2•6H2O | Sigma | M2670 |
D-Glucose | Sigma | G6152 |
HEPES | Invitrogen | 15630 |