תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

Abstract

מחקרים על לכידות התא התא התא תשתית הידבקות יש היסטורית שבוצעה על תרבויות monolayer חסיד מצעים נוקשה. תאים בתוך הרקמה, עם זאת, הם בדרך כלל עטוף בתוך מסת רקמת וצפופים שבו תאים ליצור חיבורים אינטימיים עם כמעט שכנים רבים עם רכיבים תאי מטריקס. לפיכך, המילייה כימיים כוחות פיזיים שחווים תאים בתוך רקמה 3D שונות באופן מהותי מאלה שחוו התאים גדל בתרבות monolayer. זה הוכח במידה ניכרת השפעה מורפולוגיה איתות הסלולר. כמה שיטות כבר המציאו כדי ליצור תרביות תאים 3D כולל אנקפסולציה של תאים ג'ל קולגן ¹ או ביולוגי פיגומים ^2. שיטות כאלה, בעוד שימושי, לא לשחזר את האדריכלות אינטימי ישיר תאים תאים הידבקות למצוא רקמות נורמליות. במקום זאת, הם יותר מקרוב מערכות תרבות המשוער שבו תאים בודדים מפוזרים באופן רופף בתוך meshwork 3D של מוצרי ECM. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה שבה תאים ממוקמים תלוי תרבות טיפה מודגרות בתנאים פיסיולוגיים עד שהם יוצרים spheroids 3D אמיתי שבו תאים נמצאים בקשר ישיר אחד עם השני עם רכיבים תאי מטריקס. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד והוא יכול להיות מותאם כוללים תוספת של כל סוכן ביולוגי בכמויות קטנות מאוד, כי יכול להיות עניין הבהרת השפעות על תאים תאים או תאים ECM אינטראקציה. השיטה יכולה לשמש גם לתרבות שיתוף שני (או יותר) אוכלוסיות תאים שונות על מנת להבהיר את התפקיד של אינטראקציות תאים תאים או תאים ECM של ציון יחסים מרחביים בין תאים. Cell-cell לכידות התא ECM הידבקות הם אבני היסוד של מחקרים של אינטראקציה עובריים, התפתחות תאים סרטניים, סטרומה בפלישה ממאיר, ריפוי פצעים, ועבור יישומים הנדסת רקמות. זו שיטה פשוטה תספק אמצעי ליצירת רקמות כמו אגרגטים הסלולר למדידת נכסים biomechanical או לניתוח מולקולרית ביוכימיים במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

Protocol

1. הכנת תרחיף תא בודד

1. בתרביות תאים חסיד צריך להיות מבוגר כדי מפגש 90%, monolayers ואז יש לשטוף פעמיים עם PBS. לאחר ניקוז טוב, להוסיף 2 MLS (עבור 100 צלחות מ"מ) של 0.05% טריפסין-1 mM EDTA, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד תאים לנתק. עצור trypsinization ידי הוספת 2 MLS של המדיום להשלים בעדינות להשתמש פיפטה 5 מ"ל ל triturate את התערובת עד התאים בתרחיף. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ"ל.
2. הוסף 40 μl של 10 מ"ג / מ"ל ​​DNAse מניות דגירה במשך 5 דקות ב RT. וורטקס בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות.
3. בטל supernatant ולשטוף עם גלולה 1 מ"ל להשלים בינוני רקמה תרבות. חזור, ואז התאים resuspend ב 2 MLS של המדיום רקמה שלמה תרבות.
4. ספירת התאים באמצעות hemacytometer, או נגד תא אוטומטיות ולהתאים הריכוז 2.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. להדגמה זו מונה TC10 BioRad תא אוטומטי היה בשימוש.

2. כינונה של טיפות תלויות.

1. הסר את מכסה צלחת 60 מ"מ רקמת תרבות מקום 5 MLS של PBS בתחתית הצלחת. זה ישמש חדר הידרציה.
2. הפוך את המכסה להשתמש pipettor 20 μl להפקיד 10 טיפות μl על החלק התחתון של המכסה. ודא כי טיפות ממוקמים מספיק מזה כדי לא לגעת. אפשר במקום לפחות 20 טיפות לכל מנה.
3. הפוך את המכסה על חדר-PBS מלא התחתונה לדגור על 37 ° CO 5 / _2% / 95% לחות, לעקוב אחר טיפות יומי לדגור עד או יריעות התא או אגרגטים יצרו. מיקרוסקופ סטריאופוני ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות המצרפי.
4. לאחר בצורת יריעות, הם יכולים להיות מועברים מסביב לתחתית הכוס שייקר צלוחיות המכילות 3 של ה-MLS בינוני מלא מודגרות באמבט מים רועד ב 37 ° C ו 5% CO ₂ עד טופס spheroids.

3. הערות

1. בהתאם לגודל התא, ריכוז ייתכן שיהיה צורך להתאים למעלה או למטה.
2. תאים יכולים להיות מוכתמים קרום intercalating צבעי ניאון לפני היווצרות טיפת תלוי.
3. שני סוגי תאים שונים יכול להיות מוכתם דיפרנציאלי מעורב ביחס 1:1 (או אחר) לפני היווצרות של טיפות תלויות. אלו יכולים להיות סרטן סטרומה תאים, רקמות עובריים או תאים מהונדסים גנטית יש חתימות דבק ספציפי.
4. תאים יכולים להיות מנותקת מן הכלים התרבות רקמות באמצעות טריפסין 0.05% / 2 mM סידן כדי לשמור על תפקוד cadherin.
5. בהתאם הניסוי, בגדלים גיליון יכול להימדד, או אגרגטים יכול לשמש לבדיקות מכניות או לצורך ניתוח ביוכימי או המולקולרית.

4. נציג תוצאות:

גיליון או היווצרות spheroid מתרחשת בדרך כלל תוך 24 שעות, אך עשוי להימשך זמן רב יותר, תלוי בסוג התא. איור 1 מייצג את התמונות שנתפסו לאחר 18 שעות של דגירה של מטופל הערמונית MAT-LyLu סרטן (MLL) התאים תלוי תרבות טיפה (איור 1A) או תאים שטופלו 25 מיקרומטר MEK מעכב PD98059. שים לב כי תוצאות הטיפול ב MEKi דחיסה ניכרת של גיליון התא. דחיסת ניתן לכמת על ידי מדידת גודל של 10-20 (או יותר) תלוי טיפות השוואת הגודל הממוצע בין קבוצות הטיפול. אנחנו בדרך כלל לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ ידי thresholding כל תמונה אז המרת תמונות מצב בינארי, ואז אנחנו מיישמים ניתוח החלקיקים כדי לחשוף את אזור התמונה הכוללת פיקסלים. לאחר מכן ניתן להמיר בקלות מיקרון מרובע. תרשים 2 מייצג השוואה גודל התאים MLL מטופלים ו MEKi שטופלו. כאמור, הטיפול MEKi מפחית באופן משמעותי את גודל גיליון בהשוואה ידי הסטודנטים של מבחן t (p <0.0001). לשם השוואה זו, 10 מצרפי עבור כל אחד בתאים שלא טופלו ומטופלים נמדדו. איור 3 מייצג כבד עובריים חומוס spheroid נוצרו לאחר 24 שעות תלוי תרבות ירידה ו 2 ימים באמבטיה שייקר.

Assay הירידה תלוי גם יכול להיות שונה כדי לכלול יותר מסוג אחד לתא כדי לחשוף את המיקום המרחבי מאומץ. לדוגמה, תאים עובריים חומוס כבד יכול להיות בודד, מוכתמת צבע קרום intercalating פלורסנט מעורבב עם חומוס תאים עובריים לב, כי כבר מוכתם פלורסנט סמן שונים. מראה איור 4A כי במקום הנותרים intermixed, בתאי הכבד והלב נוטים "מחוץ למיין" מתוך אחד אחר ולאמץ כדור, בתוך-a-כדור תצורה בה לתאי לב אפופים בתאי הכבד. תצורה זו ניתן להסביר את ההבדלים בין הידבקות אינטר הכבד ותאי לב. תפיסה זו היא קודיפיקציה של השערה ההפרש הידבקות אשר שימש להסביר תא מיון התנהגות בין רקמות נבט עובריים שכבת דוחי ³ ו ⁴ teleost עוברים, עבור הארגון איון תא לבלב ⁵ ועבור התא מיון בין שתי אוכלוסיות תאים זהים in כל הכבוד אחר מאשר עבור רמות ביטוי של אותו סוג של cadherin ⁽⁶ ואיור 4B). תוצאה זו חשובה במיוחד עבור המדגים כיצד הנדסה הבדל פשוט הידבקות בין אוכלוסיות תאים עלול לגרום לדור של מבנה האיבר, למשל, לבלב ^5.

באיור 1. תמונות של תאים מודגרות ב תלוי תרבות ירידה במשך 18 שעות או בהעדר (א) או נוכחות (B) של 25 מיקרומטר של מעכב ה-MEK PD98059. תמונות שנתפסו באמצעות Eclipse Nikon TE 300 מיקרוסקופ epifluorescence ו CoolSnap Photometrics ES מצלמה דיגיטלית.

איור 2. כימות הדחיסה MEKi-Induced של עכברוש הערמונית תאים סרטניים MLL. תרבויות ירידה התלויים של תאים MLL מטופלים ו MEKi שטופלו הודגרו במשך 18 שעות ואז גודל מצטבר נקבע כפי שתואר לעיל. ניתוח סטטיסטי של גודל המצרפי היה על ידי סטודנטים של t-test. כוכבית מייצג הבדל משמעותי סטטיסטית בגודל המצרפי (P <0.0001) בין תאים שלא טופלו ו MEKi שטופלו ומציע MEKi טיפול תוצאות אגרגטים קטנים משמעותית וקומפקטי יותר.

איור 3. Spheroid שהוקמה על ידי דוגרים תאים עובריים חומוס כבד תלוי תרבות ירידה במשך 18 שעות לאחר מכן באינקובטור / רועד באמבטיה במשך 48 שעות. תמונה זו נתפס באמצעות מיקרוסקופ SMZ800 Nikon סטריאו מצלמה Sony CCD שחור.

איור 4. התלויים בתרבות ירידה מגלה מיון החוצה התנהגות בין סוגי תאים שונים. בפאנל, תאים עובריים חומוס כבד הוכתמו לצבוע intercalating PKH-2 קרום מעורב בשיעורים שווים עם PKH-26 תאים עובריים מוכתם חומוס לב. בלוח ב ', שני N-cadherin-transfected תא L שיבוטים (LN4 ו LN2a), מביע N-CAD על השטח שלהם ביחס של 2.4:1, הוכתמו גם עם צבעי ניאון קרום intercalating PKH-2 ו PKH-26 , (סיגמא אולדריץ '), מעורבות בשיעורים שווים ותרבותיים כמו תלויים ⁷ טיפות. לאחר 18 שעות בתרבות, סדינים תא הועברו צלוחיות רועד מודגרות לעוד 48 שעות. המצרפים היו קבועים paraformaldehyde 2% פוספט שנאגרו מלוחים וראו עם BioRad MRC600 סריקת מערכת לייזר confocal מיקרוסקופ המחובר למיקרוסקופ Nikon Optiphot-2. סעיפים אופטי מערוצים הן ירוק ואדום נאספו Graphix הסיליקון Crimson עבודה VGX מצויד תמונות ויטל Voxel צפה תוכנה Ultra הדמיה נעשה שימוש כדי להקצות צבע שווא לשני ערוצים למזג את התמונות, חושף את תצורות אנטומי שנוצר. (א) סעיף אופטי Confocal באמצעות כיתור הוכחת המצרפי של תאים לב (כאן צבע פסאודו צהוב) על ידי תאים בכבד pseudocolor כחול (מתוך ^8). (ב) בסעיף אופטי Confocal באמצעות כיתור הוכחת המצרפי של תאים גבוה N-cadherin להביע (ירוק) על ידי אלה להביע רמות נמוכות יותר של N-cadherin (אדום) (מתוך ^6).

Discussion

מחקרים הראו כי תאי culturing בהקשר תלת ממדי (3D) מייצרת מורפולוגיה הסלולר איתות מובהק בהשוואה מערכת נוקשה (2D) דו מימדי התרבות ^9. לדוגמה, פיברובלסטים המאוכלסים ג'ל קולגן להוכיח כי מורפולוגיה פיברובלסטים ב-3D ​​הוא שונה לגמרי מזו שנצפתה 2D ^10,11. באופן דומה, תרבות 3D יכול לגרום לרקמות ספציפיות התמיינות של תאים אפיתל החלב. מערכות 3D תרבות שימשו להבחין בין תאים נורמליים ממאיר הוכחו לתמוך חזרה של תאים כדי להפוך פנוטיפ נורמלי, בהינתן הגירוי המתאים ^12,13. ארכיטקטורת רקמה נכון גם הוכח להיות חיוני לטווח ארוך , הומאוסטזיס דיכוי של אפופטוזיס, ותחזוקה של פנוטיפ מובחן של CID-9 תאים אפיתל החלב ^14. עמידות לתרופות תאיים בעכבר EMT-6 תאים סרטן השד יש גם הוכח להתבטא במבחנה רק אם התאים גדלו תצורות 3-D ולא בתרבויות monolayer קונבנציונלי ^15. נתונים אלה ואחרים הובילו להצעה כי "יחידת לתפקד יצורים עילאיים הוא לא הגנום ולא בתא לבד, אבל את הרקמה עצמה" ^16. שיטות נוספות רבות ליצירת spheroids 3D קיימים, כולל שימוש חממות כבידה מדומה ^17, ומיקרו יצוק ללא דבק הידרוג ^18,19. בשונה משיטות אלה עם זאת, השיטה המתוארת כאן אינה דורשת ציוד מיוחד או חומרים כימיים ולכן היא מאוד חסכונית. הפשטות של השיטה ממזער בעיות פוטנציאליות. כתוצאה מכך, עקומת הלמידה היא רדודה יחסית עם השיטה ניתן לשלוט בקלות בתוך פרק זמן קצר יחסית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540