En enkel droppe cellodling protokoll för generering av 3D spheroids

Summary

Vi beskriver en enkel, snabb metod för att generera 3D vävnad-liknande spheroids och deras potential ansökan att kvantifiera skillnaderna i cell-cell interaktioner.

Abstract

Studier av cell-cell sammanhållning och cell-underlag vidhäftning har historiskt utförts på monolayer kulturer anhängare till styva substrat. Celler i en vävnad, men är vanligtvis inneslutet i ett tätt vävnad massa i vilka celler etablera intima förbindelser med många nära grannar och extracellulära matrix komponenter. Följaktligen kemiska miljö och fysiska krafter som upplevs av celler i en 3D-vävnad är fundamentalt annorlunda än de som upplevs av celler som odlas i monolager kultur. Detta har visat sig påtagligt påverkar cellulär morfologi och signalering. Flera metoder har utformats för att generera 3D cellkulturer, inklusive inkapsling av celler i kollagen geler ¹ eller i biomaterial byggnadsställningar ^2. Sådana metoder, medan användbara, inte rekapitulera inte det intima direkta cell-cell adhesion arkitektur som finns i normal vävnad. Snarare de närmare ungefärliga kultur system där enskilda cellerna är löst spridda inom ett 3D meshwork av ECM-produkter. Här beskriver vi en enkel metod där cellerna är placerade i droppe kultur och inkuberas under fysiologiska förhållanden tills de bildar äkta 3D spheroids i vilka celler i direkt kontakt med varandra och med extracellulära matrix komponenter. Metoden kräver ingen specialutrustning och kan anpassas för att inkludera tillägg av biologiska agens i mycket små mängder som kan vara av intresse för att belysa effekter på cell-cell eller cell-ECM interaktion. Metoden kan också användas för att samarbeta kultur två (eller fler) olika cellpopulationer så att klarlägga vilken roll av cell-cell eller cell-ECM interaktioner i specificera rumsliga relationer mellan celler. Cell-cell sammanhållning och cell-ECM vidhäftning är hörnstenarna i studier av embryonal utveckling, tumör-stromaceller cell interaktion i maligna invasion, sårläkning och för ansökningar till tissue engineering. Denna enkla metod kommer att ge en metod för att generera vävnad-liknande cellulära aggregat för mätning av biomekaniska egenskaper eller för molekylära och biokemiska analyser i en fysiologiskt relevant modell.

Protocol

1. Beredning av en enda cell Fjädring

1. Vidhäftande cellkulturer bör odlas till 90% sammanflödet bör varefter monolager sköljas två gånger med PBS. Efter dränering väl, tillsätt 2 MLS (för 100 mm plattor) på 0,05% trypsin-1 mM EDTA, och inkubera vid 37 ° C tills cellerna lossnar. Sluta trypsinization genom att tillsätta 2 ml av kompletta medium och försiktigt använda en 5 ml-pipetten på mal sönder blandningen tills cellerna är i suspension. Överför celler till en 15 ml koniska rör.
2. Tillsätt 40 l av en 10 mg / ml DNAse lager och inkubera 5 minuter vid RT. Vortex kort och centrifugera vid 200 XG i 5 minuter.
3. Kassera supernatanten och tvätta pellets med 1 ml klar vävnadskultur medium. Upprepa sedan resuspendera celler i 2 ml av kompletta vävnadskultur medium.
4. Räkna celler med hjälp av en hemacytometer eller automatiserade celltalsräknare och justera koncentrationen till 2,5 x 10 ⁶ celler / ml. För denna demonstration ett BioRad TC10 automatiserad celltalsräknare användes.

2. Bildning av Hängande Drops.

1. Ta bort locket från en 60 mm vävnadsodling skål och placera 5 ml av PBS i botten på skålen. Detta kommer att fungera som en hydration kammare.
2. Vänd locket och använder en 20 l pipett för att sätta in 10 l droppar på undersidan av locket. Se till att dropparna är placerade tillräckligt isär så att inte röra. Det är möjligt att placera minst 20 droppar per maträtt.
3. Vänd locket på PBS fylld botten kammaren och inkubera vid 37 ° C / 5% CO ₂ / 95% luftfuktighet, övervaka droppar dagligen och inkubera tills antingen cell ark eller aggregat har bildats. En stereo mikroskop kan användas för att bedöma sammanlagda bildas.
4. När ark form, kan de överföras till rundbottnad glas shaker kolvar innehållande 3 ml av kompletta medium och inkuberas i en skakande vattenbad vid 37 ° C och 5% CO ₂ tills spheroids form.

3. Anteckningar

1. Beroende på cellens storlek kan koncentration behöva justeras uppåt eller nedåt.
2. Celler kan färgas med membran intercalating fluorescerande färger innan droppe bildas.
3. Två olika celltyper kan differentiellt färgas och blandas i ett 1:1 (eller andra) andel av BNP innan bildandet av hängande droppar. Dessa kan vara cancer och stromaceller, embryonala vävnader eller celler genetiskt konstruerad för att ha särskilda självhäftande signaturer.
4. Celler kan lossas från rätter vävnadsodling med 0,05% trypsin / 2 mm kalcium för att bevara cadherin funktion.
5. Beroende på försöket kan arkstorlekar antingen mätas eller aggregat kan användas för mekanisk provning eller för biokemiska eller molekylär analys.

4. Representativa resultat:

Blad eller sfäroid bildning inträffar vanligen inom 24 timmar men kan ta längre tid beroende på celltyp. Figur 1 representerar bilder som tagits efter 18 timmars inkubation av obehandlad prostatacancer MAT-LyLu (MLL) celler i droppe kultur (Figur 1A) eller celler som behandlats med 25 ìm MEK-hämmare PD98059. Observera att MEKi behandling resulterar i en markant packning av cellen arket. Packning kan kvantifieras genom att mäta storleken på 10-20 (eller mer) hängande droppar och jämföra genomsnittliga storleken mellan behandlingsgrupperna. Vi analyserar normalt bilder med ImageJ programvara genom tröskling varje bild sedan konvertera bilder till binärt läge, varefter vi tillämpar partikelanalys att avslöja den totala bilden området i pixlar. Detta kan sedan lätt omvandlas till torget mikrometer. Figur 2 representerar en stor jämförelse för obehandlade och MEKi behandlade MLL celler. Som nämnts minskar MEKi behandling signifikant arkstorlek jämfört med Students t-test (P <0,0001). För denna jämförelse har 10 aggregat för varje obehandlade och behandlade cellerna mätas. Figur 3 representerar en brud embryonal lever sfäroid bildas efter 24 timmar i droppe kultur och 2 dagar i en shaker bad.

Den droppe analysen kan också ändras till att omfatta mer än en celltyp att avslöja den rumsliga positionering antagits. Till exempel kan chick embryonala leverceller isoleras, färgas med ett fluorescerande membran-intercalating färg och blandas med chick embryonala hjärtceller som har målat med en annan fluorescerande markör. Figur 4A visar att istället för att vara blandade, lever-och hjärtceller tenderar att "sortera ut" från en annan och anta en sfär-i-ett-sfär konfiguration där hjärtat celler omsluts av leverceller. Denna konfiguration kan förklaras av skillnader i intercellulära vidhäftning mellan lever och celler hjärta. Detta koncept är kodifierade i Differential Vidhäftning hypotes som har använts för att förklara cellsortering beteende mellan embryonala könsceller lager vävnad för amfibie ³ och teleost ⁴ embryon för bukspottkörtelcancer holme cell organisation ⁵ och för cell sortering mellan två cellpopulationer identiska in all respekt för annat än ett uttryck nivåer av samma typ av cadherin ⁽⁶ och Figur 4B). Detta resultat är särskilt viktigt för att visa hur teknik en enkel skillnad i vidhäftning mellan cellpopulationer kan leda till uppkomsten av organ struktur, till exempel en pankreas holme ^5.

Figur 1. Bilder av celler inkuberas i droppe kultur i 18 timmar antingen i frånvaro (A) eller närvaro (B) 25 ìm av MEK-hämmare PD98059. Bilderna har tagits med en Nikon Eclipse TE 300 epifluorescensmikroskop och en ljustekniska CoolSnap ES digitalkamera.

Figur 2. Kvantifiering av MEKi-inducerad packning av råtta prostatacancer MLL celler. Droppe kulturer av obehandlade och MEKi-behandlade MLL celler inkuberades i 18 timmar varefter sammanlagda storlek bestämdes enligt ovan. Statistisk analys av totala storlek var av Students t-test. Asterisken står för en statistiskt signifikant skillnad i sammanlagda storlek (p <0,0001) mellan obehandlat och MEKi-behandlade celler och föreslår att MEKi-behandling resulterar i betydligt mindre och mer kompakt aggregat.

Figur 3. En sfäroid bildas genom inkubering chick embryonala leverceller i droppe kultur för 18 timmar sedan i en inkubator / skaka bad i 48 timmar. Denna bild har tagits med en Nikon SMZ800 stereo mikroskop och en Sony Svart CCD-kamera.

Figur 4. Droppe kultur avslöjar sortera ut beteende mellan olika celltyper. I panel A, var chick embryonala leverceller färgats med PKH-2 membran intercalating färg och blandas i lika proportioner med PKH-26 betsad chick embryonala hjärtat celler. I panel B, två N-cadherin-transfekterade L cell kloner (LN4 och LN2a), uttrycker N-CAD på deras ytor i förhållandet 2.4:1, även färgade med fluorescerande membran intercalating färgämnen PKH-2 och PKH-26 (Sigma-Aldrich), blandade i lika proportioner och odlade som hängande droppar ^7. Efter 18 timmar i kulturen, var cell lakan över till skakningar flaskor och inkuberas i ytterligare 48 timmar. Ballast fastställdes i 2% paraformaldehyd i fosfatbuffrad koksaltlösning och ses med en BioRad MRC600 scanning konfokalmikroskop systemet knuten till en Nikon Optiphot-2 mikroskop. Optisk delar från både grön och röd kanaler samlades in och en Silicon Graphix Crimson VGX arbetsstation utrustad med Vital Images Voxel Visa Ultra bildbehandlingsprogram användes för att ge falsk färg på båda kanalerna och att slå samman bilderna avslöjar anatomiska genererade konfigurationer. (A) konfokala optiska sektion genom ett aggregat som visar envelopment av hjärtceller (här i en pseudo-färg gul) av leverceller i pseudofärger blå (från ^8). (B) Confocal optiska snitt genom en sammanlagd visar envelopment av hög N-cadherin-innehållande celler (grön) av dem som uttrycker lägre nivåer av N-cadherin (röd) (från ^6).

Discussion

Studier har visat att odling celler i ett tredimensionellt sammanhang (3D) producerar distinkt cellulär morfologi och signalering jämfört med en stel tvådimensionell (2D) kultur-systemet ^9. Till exempel fibroblast befolkade kollagen geler visa att fibroblast morfologi i 3D är helt skild från den som observerats i 2D ^10,11. Likaså kan 3D kultur framkalla vävnadsspecifika differentiering av bröst epitelceller. 3D-kultur-system har använts för att skilja mellan normala och maligna celler och har visat att stödja återgång av omvandlas cellerna till normal fenotyp, med tanke på lämplig stimulans ^12,13. Korrekt vävnad arkitektur också har visat sig vara avgörande för långväga homeostas, undertryckande av apoptos, och underhåll av de differentierade fenotyp av CID-9 bröst epitelceller ^14. Flercelliga resistens i mus EMT-6 har bröstcancer celler också visat sig att manifesteras in vitro endast om cellerna odlades i 3-D-konfigurationer och inte i konventionella monolayer kulturer ^15. Dessa och andra data har lett till förslaget att "enheten för funktion i högre organismer är varken genomet eller cellen ensam, men vävnaden själv" ^16. Många andra metoder för att generera 3D spheroids finns, inklusive användning av simulerade mikrogravitation inkubatorer ^17, och mikro-gjutna icke-häftande hydrogel ^18,19. Till skillnad från dessa metoder kräver dock metoden som beskrivs här några specialutrustning eller reagenser och är därför mycket kostnadseffektiv. Enkelheten i metoden minimerar potentiella fallgropar. Följaktligen är inlärningskurvan relativt grund och metoden kan bemästras lätt inom en relativt kort tidsperiod.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540