Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Summary

Nós descrevemos um método simples e rápida de gerar tecido 3D-como esferóides e sua potencial aplicação para quantificar as diferenças de interações célula-célula.

Abstract

Estudos de célula-célula e célula substrato coesão-adesão têm sido historicamente realizados em culturas de monocamada aderente sobre substratos rígidos. Células dentro de um tecido, no entanto, normalmente são encerrados dentro de uma massa de tecido de forma compacta em que as células estabelecer conexões íntimas com muitas quase-vizinhos e com componentes da matriz extracelular. Assim, o meio químico e forças físicas experimentadas por células dentro de um tecido 3D são fundamentalmente diferentes do que aqueles experimentados por células cultivadas em cultura em monocamada. Isto tem sido demonstrado que marcadamente impacto morfologia celular e sinalização. Vários métodos têm sido desenvolvidos para gerar culturas de células em 3D, incluindo encapsulamento de células em géis de colágeno ou em ^um biomaterial andaimes ^2. Tais métodos, embora úteis, não recapitular a arquitetura de adesão íntima direto célula-célula encontrada em tecidos normais. Ao contrário, eles mais de perto os sistemas aproximados de cultura em que as células individuais são frouxamente dispersas dentro de uma malha 3D de produtos ECM. Aqui, descrevemos um método simples em que as células são colocadas em cultura pendurado queda e incubados em condições fisiológicas, até que a verdadeira forma esferóides 3D em que as células estão em contato direto uns com os outros e com componentes da matriz extracelular. O método não requer equipamento especializado e pode ser adaptado para incluir a adição de qualquer agente biológico em quantidades muito pequenas que podem ser do seu interesse na elucidação efeitos sobre célula-célula ou célula-ECM interação. O método também pode ser usado para co-cultura dois (ou mais) diferentes populações de células, de modo a elucidar o papel das interações célula-célula ou célula-ECM na especificação de relações espaciais entre as células. Célula-célula e célula coesão ECM-adesão são os pilares dos estudos de desenvolvimento embrionário interação celular, tumor de estroma na invasão maligna, cicatrização de feridas, e para aplicações de engenharia de tecidos. Este método simples irá fornecer um meio de gerar tecido celular-como agregados para a medição de propriedades biomecânicas ou para análise molecular e bioquímica em um modelo fisiologicamente relevantes.

Protocol

1. Preparação de uma suspensão de células Único

1. Culturas de células aderentes devem ser cultivadas a confluência de 90%, quando então monocamadas devem ser lavados duas vezes com PBS. Depois de drenar bem, adicionar 2 ml (para 100 placas mm) de 0,05% de tripsina-EDTA 1 mM, e incubar a 37 ° C até que as células detach. Parar tripsinização adicionando 2 ml de meio completo e gentilmente usar uma pipeta de 5 ml para triturar a mistura até que as células estão em suspensão. Transferência de células para um tubo de 15 ml.
2. Adicionar 40 mL de uma 10 mg / ml DNAse estoque e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Brevemente Vortex e centrifugar a 200 xg por 5 minutos.
3. Elimine o sobrenadante e lavar pellet com 1 ml completa meio de cultura de tecidos. Repita, então as células ressuspender em 2 ml de meio completo de cultura de tecidos.
4. Contar as células usando um hemocitômetro, ou contador de células automatizado e ajustar a concentração para 2,5 x 10 ⁶ células / ml. Para esta demonstração BioRad um contador de células automatizado TC10 foi usado.

2. Formação de gotas de suspensão.

1. Remova a tampa de um prato de 60 milímetros de cultura de tecidos e coloque 5 ml de PBS no fundo do prato. Este funcionará como uma câmara de hidratação.
2. Inverter a tampa e use uma pipeta 20 l para depositar 10 gotas mL para o fundo da tampa. Certifique-se que gotas são colocadas suficientemente distante para não tocar. É possível colocar pelo menos 20 gotas por prato.
3. Inverter a tampa do PBS-cheia câmara inferior e incubar a 37 ° CO C / 5% ₂ / 95% de umidade, monitorar as gotas diárias e incubar até folhas ou células ou agregados formaram. Um microscópio estéreo pode ser usado para avaliar a formação de agregados.
4. Uma vez que formam folhas, podem ser transferidos para fundo redondo de vidro shaker frascos contendo 3 ml de meio completo e incubados em um agitador banho maria a 37 ° C e 5% CO ₂ até formar esferóides.

3. Notas

1. Dependendo do tamanho da célula, a concentração pode precisar de ser ajustado para cima ou para baixo.
2. As células podem ser marcadas com corantes fluorescentes membrana intercalando antes da formação gota suspensa.
3. Dois tipos de células diferentes podem ser diferencialmente manchada e misturado na proporção de 1:1 (ou outro) antes da formação de gotas de suspensão. Estes podem ser câncer e estroma células, tecidos embrionárias, ou células geneticamente modificados para ter as assinaturas adesivo específico.
4. As células podem ser separados de pratos de cultura de tecidos utilizando tripsina 0,05% / 2 mM de cálcio para preservar a função caderina.
5. Dependendo do experimento, tamanhos de folha pode ser medido, ou agregados pode ser usado para ensaios mecânicos ou por análise bioquímica ou molecular.

4. Resultados representativos:

Folha ou formação esferóide normalmente ocorre no prazo de 24 horas, mas pode demorar mais dependendo do tipo de célula. A Figura 1 representa as imagens capturadas após 18 horas de incubação de câncer de próstata não tratado MAT-LyLu (MLL) células em suspensão cultura gota (Figura 1A) ou células tratadas com 25 mm inibidor MEK PD98059. Note-se que os resultados do tratamento Meki em uma compactação marcadas da camada de células. Compactação pode ser quantificado através da medição do tamanho de 10-20 (ou mais) pendurado cai e comparando tamanho médio entre os grupos de tratamento. Normalmente, analisar imagens utilizando o software ImageJ por thresholding cada imagem, em seguida, converter imagens para o modo binário, após o que aplicar a análise de partículas para revelar a área total da imagem em pixels. Isto pode ser facilmente convertida em microns quadrados. A Figura 2 apresenta uma comparação de tamanho para as células não tratadas e Meki MLL-tratada. Como se observa, o tratamento reduz significativamente Meki tamanho da folha em comparação de Student t-test (P <0,0001). Para esta comparação, 10 agregados para cada uma das células tratadas e não tratadas foram medidos. A Figura 3 representa um pintinho esferóide fígado embrionário formado após 24 horas pendurado em cultura queda e dois dias em um banho de shaker.

O ensaio de gota em suspensão também pode ser modificado para incluir mais de um tipo de célula para revelar o posicionamento espacial adotada. Por exemplo, células do fígado pinto embrionárias podem ser isoladas, marcadas com um corante fluorescente intercalando membrana e misturado com células embrionárias do coração de galinha que foram marcadas com um marcador fluorescente diferentes. Mostra a figura 4A, que ao invés de permanecer misturados, as células do fígado e do coração tendem a "resolver" a partir de um outro e adotar uma esfera-dentro-de uma esfera de configuração em que as células cardíacas são envolvidas por células do fígado. Esta configuração pode ser explicada por diferenças na adesão intercelular entre células do fígado e coração. Este conceito é codificada na Hipótese de Adesão diferencial que tem sido usada para explicar o comportamento de células de classificação entre o tecido embrionário germe camada de anfíbios ³ e ⁴ teleost embriões, células pancreáticas para a organização das ilhotas ⁵ e para a célula de classificação entre duas populações de células idênticas in todos os outros aspectos do que para os níveis de expressão do mesmo tipo de caderina ⁽⁶ e Figura 4B). Este resultado é particularmente importante para demonstrar como a engenharia uma simples diferença na adesão entre populações de células pode resultar na geração de estrutura do órgão, por exemplo, uma das ilhotas pancreáticas ^5.

Figura 1. Imagens de células incubadas em cultura queda pendurado por 18 horas ou, na ausência (A) ou presença (B) de 25 mm do inibidor de MEK PD98059. As imagens foram captadas com uma Nikon Eclipse TE 300 e um microscópio de epifluorescência fotométricos CoolSnap ES câmera digital.

Figura 2. Quantificação de Meki induzida compactação de ratos células cancerígenas da próstata MLL. Culturas gotas de suspensão de células não tratadas e Meki MLL-tratados foram incubados por 18 horas whereupon tamanho agregado foi determinado como descrito acima. Análise estatística do tamanho de agregados foi por teste t de Student. O asterisco representa uma diferença estatisticamente significativa no tamanho do agregado (P <0,0001) entre as células não tratadas e tratadas com Meki e sugere que os resultados Meki-tratamento em agregados significativamente menores e mais compactos.

Figura 3. Um esferóide formada pela incubação de células embrionárias de fígado em pinto pendurado cultura queda para 18 horas, em seguida, em uma incubadora / agitação do banho por 48 horas. Esta imagem foi capturada com um microscópio estéreo Nikon SMZ800 e um Sony Preto câmera CCD.

Figura 4. Hanging cultura queda revela-out de classificação de comportamento entre diferentes tipos celulares. No painel A, as células do fígado pinto embrionárias foram coradas com PKH-2 da membrana corante intercalando e misturados em proporções iguais com PKH-26 manchado pinto células cardíacas embrionárias. No painel B, dois N-caderina-transfectadas clones L celular (LN4 e LN2a), expressando N-cad em suas superfícies na proporção de 2,4:1, também foram coradas com os corantes fluorescentes membrana intercalando PKH-2 e PKH-26 , (Sigma-Aldrich), misturados em proporções iguais e culta como a suspensão de gotas ^7. Após 18 horas de cultura, folhas de células foram transferidas para frascos de agitação e incubadas por mais 48 horas. Agregados foram fixadas em paraformaldeído 2% em tampão fosfato e visto com um sistema de digitalização a laser BioRad MRC600 microscópio confocal acoplada a um microscópio Nikon Optiphot-2. Secções ópticas de ambos os canais verde e vermelho foram coletados e uma estação de trabalho Silicon Graphix Carmesim VGX equipado com Imagens Vital Voxel Ver Ultra software de imagem foi usado para atribuir falsa cor para ambos os canais e fundir as imagens, revelando as configurações anatômicas geradas. (A) secção óptica confocal através de um envolvimento total das células do coração demonstrando (aqui em uma cor amarelo-pseudo) pelas células do fígado em pseudo-azul (de ^8). (B) seção Confocal óptica através de um envolvimento total demonstrando alta de N-caderina células que expressam (verde) por aqueles que expressam os níveis mais baixos de N-caderina (vermelho) (de ^6).

Discussion

Estudos têm demonstrado que a cultura de células em um contexto tridimensional (3D) produz morfologia celular e sinalização distintas quando comparado a um rígido sistema de cultura de duas dimensões (2D) ^9. Por exemplo, géis de fibroblastos de colágeno povoadas demonstram que a morfologia de fibroblastos em 3D é bastante distinta da observada em 2D ^10,11. Da mesma forma, a cultura 3D pode induzir a diferenciação de tecidos específicos de células epiteliais mamárias. Sistemas de cultura 3D têm sido utilizados para distinguir entre células normais e malignas e têm sido mostrados para apoiar a reversão de células transformadas para o fenótipo normal, dado o estímulo apropriado ^12,13. Arquitetura do tecido correta também tem sido demonstrado ser vital para longo alcance supressão de homeostase, de apoptose, e manutenção do fenótipo diferenciado de CID-9 células epiteliais mamárias ^14. Resistência às drogas multicelulares em rato EMT-6 células de carcinoma mamário também foi mostrado para ser manifestada in vitro somente se as células foram cultivadas em configurações 3-D e não em culturas convencionais monocamada ^15. Estes e outros dados levaram à proposta de que "a unidade da função em organismos superiores não é nem o genoma da célula, nem sozinho, mas o tecido em si" ^16. Muitos outros métodos de geração de esferóides 3D existir, incluindo o uso de incubadoras de microgravidade simulada ^17, e micro-moldadas não adesiva hidrogéis ^18,19. Ao contrário destes métodos no entanto, o método descrito aqui não requer equipamentos especializados ou reagentes e é, portanto, altamente rentável. A simplicidade do método minimiza potenciais armadilhas. Consequentemente, a curva de aprendizagem é relativamente raso eo método pode ser dominado facilmente dentro de um período relativamente curto de tempo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540