Summary
हम एक सरल, 3D ऊतक की तरह spheroids और उनके संभावित आवेदन पैदा करने के लिए सेल सेल बातचीत में मतभेद यों के तेजी से विधि का वर्णन.
Abstract
सेल सेल सामंजस्य और सेल बुनियाद आसंजन के अध्ययन ऐतिहासिक monolayer कठोर substrates के अनुयायी संस्कृतियों पर प्रदर्शन किया गया है. एक ऊतक के भीतर कक्ष, तथापि, आम तौर पर एक पैक निकट ऊतक मास में जो कोशिकाओं को बहुत निकट पड़ोसियों के साथ और बाह्य मैट्रिक्स घटकों के साथ अंतरंग कनेक्शन स्थापित के भीतर encased हैं. तदनुसार, रासायनिक परिवेश और शारीरिक एक 3D ऊतक के भीतर कोशिकाओं द्वारा अनुभवी बलों मौलिक monolayer संस्कृति में विकसित कोशिकाओं द्वारा अनुभवी उन से अलग हैं. यह स्पष्ट रूप से सेलुलर आकारिकी और संकेत प्रभाव दिखाया गया है. कई तरीकों कोलेजन 1 जैल में biomaterial scaffolds में 2 या कक्षों की encapsulation सहित 3 डी सेल संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए तैयार किया गया है. इस तरह के तरीकों, जबकि उपयोगी, अंतरंग प्रत्यक्ष आसंजन सेल सेल के सामान्य ऊतकों में पाया वास्तुकला नहीं पुनरावृत्ति करते हैं. बल्कि, वे और अधिक बारीकी से अनुमानित संस्कृति प्रणालियों में जो एकल कक्षों शिथिल ईसीएम उत्पादों की एक 3D meshwork के भीतर बिखरे हैं. यहाँ, हम एक सरल विधि है जिसमें कोशिकाओं को फांसी ड्रॉप संस्कृति में रखा जाता है और शारीरिक शर्तों के तहत incubated जब तक वे सच 3D spheroids में जो कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ और बाह्य मैट्रिक्स घटकों के साथ सीधे संपर्क में रहे हैं के रूप में वर्णन. विधि कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और बहुत छोटी मात्रा में है कि ब्याज की सेल कोशिका या सेल ECM बातचीत पर प्रभाव elucidating में हो सकता है किसी भी जैविक एजेंट के अलावा शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. विधि को भी दो सह संस्कृति (या अधिक) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अलग अलग सेल आबादी इतनी के रूप में कोशिकाओं के बीच स्थानिक रिश्तों निर्दिष्ट में सेल कोशिका या सेल ईसीएम बातचीत की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए. सेल सेल सामंजस्य और सेल ECM आसंजन भ्रूण के विकास, ट्यूमर stromal घातक आक्रमण, घाव भरने, और ऊतक इंजीनियरिंग के लिए अनुप्रयोगों के लिए में सेल बातचीत के अध्ययन के cornerstones हैं. इस सरल विधि biomechanical गुणों की माप के लिए या एक physiologically प्रासंगिक मॉडल में आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए सेलुलर समुच्चय की तरह ऊतक पैदा करने के साधन प्रदान करेगा.
Protocol
1. एक सिंगल सेल सस्पेंशन की तैयारी
- पक्षपाती सेल संस्कृतियों 90% संगम हो जाना चाहिए, जिस monolayers पीबीएस के साथ दो बार rinsed चाहिए. अच्छी तरह से draining के बाद, 2 0.05% trypsin 1 मिमी EDTA के mls (100 मिमी प्लेटों के लिए) जोड़ने के लिए, और 37 पर सेते ° सी जब तक कोशिकाओं को अलग. 2 mls का पूरा मध्यम जोड़ने और धीरे से एक 5 मिलीलीटर विंदुक का उपयोग करने के लिए मिश्रण triturate जब तक कोशिकाओं को निलंबन में हैं trypsinization बंद करो. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण.
- आरटी पर 5 मिनट के लिए एक 10 मिलीग्राम / एमएल DNase शेयर और सेते के 40 μl जोड़ें. भंवर और 5 मिनट के लिए 200 XG संक्षेप में अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और गोली के साथ एक मिलीलीटर पूरी तरह से टिशू कल्चर माध्यम धो. दोहराएँ, तो पूरा टिशू कल्चर के माध्यम से 2 mls में resuspend कोशिकाओं.
- Hemacytometer, या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गिनती और 2.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल एकाग्रता समायोजित. इस प्रदर्शन के लिए एक BioRad TC10 स्वचालित सेल काउंटर इस्तेमाल किया गया था.
2. हैंगिंग ड्रॉप का गठन.
- एक 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान और डिश के तल में पीबीएस की 5 mls जगह से ढक्कन हटाएँ. यह एक जलयोजन चैम्बर के रूप में कार्य करेगा.
- ढक्कन उलटें और एक 20 μl pipettor का उपयोग करने के लिए ढक्कन के नीचे पर 10 μl बूँदें जमा. यकीन है कि बूंदों पर्याप्त अलग रखा जाता है ताकि के रूप में नहीं छूने के लिए. यह संभव है पकवान प्रति कम से कम 20 बूँदें जगह.
- पीबीएस भर नीचे कक्ष और 37 पर सेते ° सी / 5% सीओ 2 / 95% आर्द्रता पर ढक्कन उलटें की निगरानी, दैनिक बूँदें और सेते हैं जब तक या तो सेल चादरें या समुच्चय का गठन किया है . एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप कुल गठन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक बार चादरें फार्म, वे दौर नीचे कांच हिलनेवाला को हस्तांतरित किया जा सकता है युक्त बोतल 3 mls का पूरा मध्यम और 37 पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में incubated डिग्री सेल्सियस और spheroids फार्म तक 5% सीओ 2 .
3. नोट्स
- सेल के आकार पर निर्भर करता है, एकाग्रता के लिए ऊपर या नीचे समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है.
- कोशिकाओं झिल्ली intercalating फ्लोरोसेंट रंजक फांसी ड्रॉप गठन से पहले के साथ दाग जा सकता है.
- दो अलग अलग सेल प्रकार का हो सकता है और विभिन्न दाग कर सकते हैं (या अन्य) एक 1:1 फांसी बूंदों के गठन से पहले अनुपात में मिलाया. ये कैंसर और stromal कोशिकाओं, भ्रूण के ऊतकों, या आनुवंशिक रूप से विशिष्ट चिपकने वाला हस्ताक्षर है इंजीनियर कोशिकाओं जा सकता है.
- कक्ष टिशू कल्चर व्यंजन से अलग किया जा सकता है है cadherin समारोह के संरक्षण के लिए 0.05% trypsin / 2 मिमी कैल्शियम का उपयोग करने के लिए.
- प्रयोग के आधार पर, पत्रक आकार, या तो मापा जा सकता है या समुच्चय यांत्रिक परीक्षण के लिए या जैव रासायनिक या आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
शीट या उपगोल गठन आम तौर पर 24 घंटे के भीतर होता है लेकिन अब लेने कोशिका प्रकार के आधार पर हो सकता है. चित्रा 1 ऊष्मायन के 18 घंटे के बाद इलाज प्रोस्टेट कैंसर मेट - LyLu फांसी ड्रॉप संस्कृति में कोशिकाओं (MLL) (चित्रा 1 ए) या 25 MEK PD98059 अवरोध करनेवाला सुक्ष्ममापी के साथ इलाज किया कोशिकाओं के कब्जा कर लिया छवियों का प्रतिनिधित्व करता है. नोट कि सेल पत्रक के एक चिह्नित संघनन में MEKi उपचार के परिणाम. संहनन 10-20 (या अधिक) के आकार बूँदें फांसी और उपचार समूहों के बीच औसत आकार की तुलना मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है. हम आम तौर पर प्रत्येक छवि तो thresholding परिवर्तित द्विआधारी मोड के लिए छवियों को ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण, जिस हम कण विश्लेषण करने के लिए पिक्सल में कुल छवि क्षेत्र प्रकट लागू. यह तो आसानी से वर्ग microns से परिवर्तित किया जा सकता है. चित्रा 2 अनुपचारित और MEKi इलाज MLL कोशिकाओं के लिए एक आकार की तुलना का प्रतिनिधित्व करता है. के रूप में उल्लेख किया, MEKi उपचार काफी पत्रक आकार को कम कर देता है के रूप में छात्र के टी परीक्षण (पी <.0001) द्वारा तुलना. इस तुलना के लिए, इलाज और इलाज कोशिकाओं में से प्रत्येक के लिए 10 समुच्चय मापा गया. चित्रा 3 एक लड़की भ्रूण जिगर ड्रॉप संस्कृति फांसी में 24 घंटे और एक प्रकार के बरतन स्नान में 2 दिन के बाद का गठन उपगोल का प्रतिनिधित्व करता है.
फांसी ड्रॉप परख भी एक से अधिक सेल प्रकट करने के लिए स्थानिक स्थिति को अपनाया प्रकार शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, लड़की भ्रूण जिगर की कोशिकाओं, अलग किया जा सकता है एक फ्लोरोसेंट रंजक झिल्ली intercalating दाग और लड़की भ्रूण हृदय कोशिकाओं है कि एक अलग फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ दाग है के साथ मिश्रित. चित्रा 4A से पता चलता है कि शेष के बजाय intermixed, जिगर और हृदय कोशिकाओं "क्रमबद्ध करें बाहर" करने के लिए एक दूसरे से करते हैं और अपनाने एक क्षेत्र के भीतर क्षेत्र के विन्यास में जो हृदय कोशिकाओं जिगर की कोशिकाओं द्वारा छा रहे हैं. यह विन्यास जिगर और हृदय कोशिकाओं के बीच कहनेवाला आसंजन में मतभेद के द्वारा समझाया जा सकता है. इस अवधारणा है जो सेल समझाने 3 उभयचर और teleost 4 भ्रूण भ्रूण रोगाणु परत ऊतक के बीच व्यवहार के लिए अग्नाशय आइलेट सेल संगठन के लिए 5 और दो मैं समान सेल आबादी के बीच सेल छँटाई के लिए छँटाई, करने के लिए इस्तेमाल किया गया है विभेदक आसंजन हाइपोथीसिस में संहिताबद्ध हैn cadherin (6 4B चित्रा) के एक ही प्रकार की अभिव्यक्ति के स्तर के लिए की तुलना में हर दूसरे के सम्मान. यह परिणाम प्रदर्शन कैसे सेल आबादियों के बीच आसंजन में एक साधारण अंतर इंजीनियरिंग के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण अंग संरचना की पीढ़ी में परिणाम कर सकते हैं उदाहरण के लिए, एक अग्नाशय आइलेट 5.
चित्रा 1 18 घंटे के लिए (ए) के अभाव या उपस्थिति में या तो ड्रॉप संस्कृति फांसी में incubated कोशिकाओं की छवियाँ (बी) MEK अवरोध करनेवाला PD98059 के 25 सुक्ष्ममापी की. छवियाँ एक Nikon ग्रहण ते 300 epifluorescence खुर्दबीन और Photometrics CoolSnap ES डिजिटल कैमरे का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया.
चित्रा 2 के चूहा प्रोस्टेट कैंसर MLL कोशिकाओं के MEKi प्रेरित संघनन की मात्रा का ठहराव . इलाज और MEKi इलाज MLL कोशिकाओं के हैंगिंग ड्रॉप संस्कृतियों 18 घंटे के लिए incubated रहे थे जिस कुल आकार ऊपर वर्णित के रूप में निर्धारित किया गया था. कुल आकार के सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा विद्यार्थी का t-परीक्षण किया गया था. तारांकन कुल आकार में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर (पी <0.0001) काफी छोटे और अधिक कॉम्पैक्ट समुच्चय में इलाज और MEKi इलाज कोशिकाओं और पता चलता है कि MEKi उपचार के परिणाम के बीच का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3. 18 घंटे के लिए ड्रॉप संस्कृति तो / एक मशीन में 48 घंटे के लिए फांसी स्नान मिलाते में लड़की भ्रूण जिगर की कोशिकाओं incubating द्वारा गठित उपगोल . इस छवि को एक Nikon SMZ800 स्टीरियो माइक्रोस्कोप और एक सोनी काले सीसीडी कैमरा का उपयोग कर कब्जा कर लिया था.
चित्रा 4 हैंगिंग ड्रॉप संस्कृति विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच व्यवहार के बाहर छँटाई का पता चलता है. पैनल में एक लड़की भ्रूण जिगर की कोशिकाओं PKH-2 झिल्ली intercalating डाई के साथ दाग थे और PKH-26 दाग लड़की भ्रूण हृदय कोशिकाओं के साथ बराबर अनुपात में मिश्रित. पैनल बी में, दो एन cadherin - ट्रांसफ़ेक्ट एल कक्ष (LN4 और LN2a) क्लोन, 2.4:1 के अनुपात में उनके सतहों पर एन पाजी व्यक्त भी फ्लोरोसेंट झिल्ली intercalating PKH-2 रंजक और PKH-26 के साथ दाग थे (सिग्मा Aldrich), बराबर अनुपात में मिलाया और 7 बूँदें फांसी के रूप में सुसंस्कृत. संस्कृति में 18 घंटे के बाद, सेल शीट मिलाते बोतल के लिए स्थानांतरित कर दिया गया और एक और 48 घंटे के लिए incubated. समुच्चय 2% paraformaldehyde में तय किया गया खारा फॉस्फेट-buffered BioRad MRC600 स्कैनिंग लेजर confocal खुर्दबीन एक Nikon Optiphot-2 खुर्दबीन से जुड़ी प्रणाली के साथ देखा. दोनों हरे और लाल चैनल से ऑप्टिकल वर्गों को एकत्र किया गया और एक सिलिकॉन Graphix क्रिमसन VGX महत्वपूर्ण छवियाँ के साथ सुसज्जित वर्कस्टेशन Voxel देखें अल्ट्रा इमेजिंग सॉफ्टवेयर दोनों चैनलों के लिए झूठी रंग असाइन करने के लिए और छवियों को मर्ज, संरचनात्मक उत्पन्न विन्यास खुलासा किया था. (ए) हृदय कोशिकाओं की एक समग्र प्रदर्शन लपेटना माध्यम Confocal ऑप्टिकल pseudocolor नीले में जिगर की कोशिकाओं (8) से (यहाँ एक छद्म रंग पीला में) अनुभाग. (बी) के माध्यम से Confocal ऑप्टिकल अनुभाग उच्च एन cadherin एन cadherin (लाल) (6) के निचले स्तर पर व्यक्त उन लोगों द्वारा व्यक्त कोशिकाओं (हरा) की एक समग्र प्रदर्शन लपेटना.
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Discussion
अध्ययनों से पता चला है कि एक तीन आयामी (3 डी) संदर्भ में संवर्धन कोशिकाओं को अलग सेलुलर आकारिकी और संकेत है जब एक कठोर दो आयामी (2d) संस्कृति 9 प्रणाली की तुलना में उत्पादन. उदाहरण के लिए, fibroblast आबादी कोलेजन जैल दिखाना है कि 3 डी में fibroblast आकारिकी 2D 10,11 में मनाया से काफी अलग है . इसी तरह, 3D संस्कृति ऊतक विशिष्ट स्तन उपकला कोशिकाओं की भिन्नता पैदा कर सकते हैं. 3D संस्कृति प्रणालियों के लिए सामान्य और घातक कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और सामान्य phenotype बदल कोशिकाओं के प्रत्यावर्तन का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है, उचित 12,13 प्रोत्साहन दिया सही ऊतक वास्तुकला भी लंबी दूरी के लिए महत्वपूर्ण हो दिखाया गया है है. apoptosis के homeostasis दमन, और सीआईडी 9 स्तन 14 उपकला कोशिकाओं विभेदित phenotype के रखरखाव. माउस में multicellular दवा प्रतिरोध EMT 6 स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं को भी इन विट्रो में प्रकट हो गया है दिखाया गया है सिर्फ अगर कोशिकाओं पारंपरिक monolayer 15 संस्कृतियों में 3 डी और विन्यास में बड़े हो रहे थे. इन और अन्य डेटा प्रस्ताव करने के लिए नेतृत्व किया है कि 16 "उच्च जीवों में समारोह की इकाई यह न तो जीनोम और न ही अकेले सेल, लेकिन ऊतक ही है ". 3D spheroids पैदा करने की कई अन्य तरीकों मौजूद है, नकली microgravity 17 इन्क्यूबेटरों, और सूक्ष्म ढाला गैर चिपकने वाला 18,19 hydrogels के उपयोग सहित. इन विधियों के विपरीत, तथापि, यहाँ वर्णित विधि कोई विशेष उपकरणों या अभिकर्मकों की आवश्यकता है और इसलिए उच्च लागत प्रभावी है. विधि की सादगी संभावित नुकसान minimizes. नतीजतन, सीखने की अवस्था अपेक्षाकृत उथले है और विधि समय की एक अपेक्षाकृत छोटी अवधि के भीतर आसानी से महारत हासिल कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखक के लिए तकनीकी सहायता के लिए डॉ. Dongxuan जिया धन्यवाद देना चाहूंगा. इस लेख में प्रदर्शित होने के कुछ छवियों डॉ. मैल्कम एस स्टाइनबर्ग, आण्विक जीवविज्ञान विभाग, प्रिंसटन विश्वविद्यालय के साथ सहयोग में थे. लेखक भी रक्षा प्रोस्टेट कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (पीसी 030,482 अनुदान और पीसी 991,552) के विभाग और / NCI NIH (R01CA118755 अनुदान) अपने उदार सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic cell counter | Bio-Rad | TC10 | |
| shaking water bath with CO2 gable cover | Labline Instruments | 3540 |
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