A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Summary

Wir beschreiben eine einfache, schnelle Methode zur Erzeugung von 3D-Gewebe-like Sphäroide und ihre mögliche Anwendung auf Unterschiede in der Zell-Zell-Interaktionen zu quantifizieren.

Abstract

Studium der Zell-Zell-Kohäsion und Zell-Substrat Adhäsion haben in der Vergangenheit auf Monolayerkulturen Anhänger auf starren Substraten durchgeführt. Zellen innerhalb eines Gewebes, jedoch sind in der Regel innerhalb eines dicht gepackten Gewebemasse in die Zellen zu etablieren intimen Verbindungen mit vielen nahen Nachbarn und mit Komponenten der extrazellulären Matrix umgeben. Dementsprechend sind die chemischen Milieu und körperlichen Kräfte durch die Zellen in einer 3D-Gewebe erfahrenen grundlegend anders als die von den Zellen in Monolayer-Kultur gezüchtet erlebt. Dies hat sich gezeigt, dass deutlich Auswirkungen zelluläre Morphologie und Signalisierung. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um 3D-Zellkulturen, einschließlich Verkapselung von Zellen in Kollagen-Gelen ¹ oder in Biomaterial Gerüste ^{2 zu} erzeugen. Solche Methoden, die brauchbar sind, nicht rekapitulieren die intime direkte Zell-Zell-Adhäsion Architektur in gesundem Gewebe. Vielmehr sie enger ungefähre Kultur Systemen, in denen einzelne Zellen sind locker innerhalb einer 3D-Geflecht von ECM-Produkte verteilt. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, bei der Zellen in hängenden Tropfen Kultur gelegt und bebrütet unter physiologischen Bedingungen, bis sie echte 3D Sphäroide in die Zellen stehen in direktem Kontakt miteinander und mit Komponenten der extrazellulären Matrix zu bilden. Das Verfahren erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann an Zusatz von biologischen in sehr geringen Mengen, die von Interesse bei der Aufklärung Auswirkungen auf Zell-Zell-oder Zell-ECM-Interaktion kann erweitert werden. Das Verfahren kann auch zur Co-Kultur von zwei (oder mehr) eingesetzt werden unterschiedliche Zellpopulationen, um so die Rolle der Zell-Zell-oder Zell-ECM-Interaktionen in der Angabe räumlichen Beziehungen zwischen den Zellen aufzuklären. Zell-Zell-Kohäsion und Zell-ECM Haftung sind die Eckpfeiler des Studiums der embryonalen Entwicklung, Tumor-Stroma-Zell-Interaktion im malignen Invasion, Wundheilung, und für Anwendungen auf Tissue Engineering. Diese einfache Methode wird ein Mittel zur Erzeugung von Tissue-like zelluläre Aggregate für die Messung der biomechanischen Eigenschaften oder für die molekulare und biochemische Analyse in einem physiologisch relevanten Modell.

Protocol

1. Erstellung eines Single Cell Suspension

1. Adhärenten Zellkulturen zu 90% Konfluenz sollten angebaut werden sollten, worauf Monoschichten zweimal mit PBS gespült werden. Nach dem Ablassen gut, fügen Sie 2 ml (für 100 mm-Platten) von 0,05% Trypsin-1 mM EDTA, und bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen. Stoppen Trypsinierung durch Zugabe von 2 ml Vollmedium und sanft mit einem 5 ml-Pipette auf die Mischung verreiben, bis die Zellen in Suspension. Transfer-Zellen auf eine 15 ml konischen Rohr.
2. Add 40 ul einer 10 mg / ml DNAse Lager und Inkubation für 5 Minuten bei RT. Vortex kurz und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten.
3. Überstand verwerfen und Pellet waschen mit 1 ml komplettem Zellkulturmedium. Wiederholen Sie dann die Zellen in 2 ml komplette Zellkulturmedium.
4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämacytometer oder automatisierte Zellzahl und passen Konzentration auf 2,5 x 10 ⁶ Zellen / ml. Für diese Demonstration eine BioRad TC10 automatisierte Zelle Zähler verwendet wurde.

2. Die Bildung von hängenden Tropfen.

1. Entfernen Sie den Deckel von einem 60 mm Gewebe-Kulturschale und Platz 5 ml PBS in den Boden der Schale. Dies wird als Hydratation Kammer handeln.
2. Drehen Sie die Deckel und die Verwendung eines 20 ul Pipette zu 10 ul Tropfen auf der Unterseite des Deckels zu hinterlegen. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen ausreichend voneinander entfernt sind so platziert, wie nicht zu berühren. Es ist möglich, mindestens 20 Tropfen pro Teller platzieren.
3. Drehen Sie die Deckel wieder auf das PBS-gefüllten unteren Kammer und bei 37 ° C / 5% CO ₂ / 95% Luftfeuchtigkeit, überwachen die Tropfen täglich und inkubieren, bis entweder Zellschichten oder Aggregate gebildet haben. Ein Stereo-Mikroskop kann verwendet werden, um Aggregatbildung zu beurteilen.
4. Sobald Blätter zu bilden, sie können, um mit rundem Boden Glas Schüttler übertragen werden Kolben mit 3 ml Vollmedium und inkubiert in einem Schüttel-Wasserbad bei 37 ° C und 5% CO ₂ bis Sphäroide zu bilden.

3. Hinweise

1. Je nach Größe der Zellen kann Konzentration müssen nach oben oder unten angepasst werden.
2. Die Zellen können mit Membran interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe vor dem Aufhängen Tropfenbildung gefärbt werden.
3. Zwei verschiedene Zelltypen können unterschiedlich gefärbt sein und in einer 1:1 (oder andere)-Verhältnis vor der Bildung der hängende Tropfen gemischt. Diese können Krebs und Stromazellen, embryonalen Geweben oder Zellen gentechnisch verändert, um spezifische Kleber Signaturen haben.
4. Die Zellen können aus Gewebekulturschalen abgenommen werden mit 0,05% Trypsin / 2 mM Kalzium Cadherin-Funktion zu bewahren.
5. Je nach Experiment können Blattgrößen entweder gemessen werden oder Aggregate für die mechanische Prüfung oder für biochemische oder molekulare Analyse verwendet werden.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Blatt-oder Sphäroid Bildung tritt in der Regel innerhalb von 24 Stunden, kann aber länger dauern, je nach Zelltyp. Abbildung 1 zeigt Bilder nach 18 Stunden Inkubation von unbehandelten Prostatakarzinom MAT-LyLu (MLL)-Zellen in hängenden Tropfen Kultur (Abbildung 1A) oder Zellen mit 25 &mgr; MEK-Inhibitor PD98059 behandelt eingefangen. Beachten Sie, dass Meki Behandlung führt zu einer deutlichen Verdichtung der Zellschicht. Verdichtung kann durch die Messung der Größe 10-20 (oder mehr) hängende Tropfen und Vergleich der durchschnittlichen Größe zwischen den Behandlungsgruppen quantifiziert werden. Wir analysieren in der Regel Bilder mit ImageJ Software Schwellwerte jedes Bild dann Konvertieren von Bildern in Binary-Modus, worauf wir Partikelanalyse den gesamten Bildbereich in Pixel offenbart hat. Dies kann dann leicht zu Quadrat-Mikrometer umgewandelt werden. Abbildung 2 stellt einen Größenvergleich für unbehandelte und Meki behandelten MLL-Zellen. Wie bereits erwähnt, Meki Behandlung deutlich reduziert Bogenformat als durch den Student-t-Test (P <0,0001). Für diesen Vergleich wurden 10 Aggregate für jeden der unbehandelten und behandelten Zellen gemessen. Abbildung 3 stellt ein Küken embryonalen Leber Sphäroid nach 24 Stunden in hängenden Tropfen Kultur und 2 Tage in einem Schüttelbad gebildet.

Die hängenden Tropfen Assay kann auch geändert werden, um mehr als einen Zelltyp zu offenbaren, die räumliche Positionierung verabschiedet wurden. Zum Beispiel kann chick embryonalen Leberzellen isoliert, gefärbt mit einem fluoreszierenden Membran-interkalierende Farbstoff und mit chick embryonalen Herzzellen, die mit verschiedenen fluoreszierenden Marker wurden gefärbt. 4A zeigt, dass anstatt verbleibenden vermischt, neigen Leber-und Herzzellen zu "sort-out" von einem anderen und nehmen eine Kugel-in-a-Kugel-Konfiguration in die Herzzellen sind umhüllt von Leberzellen. Diese Konfiguration kann durch Unterschiede in der interzellulären Adhäsion zwischen Leber und Herz-Zellen erklärt werden. Dieses Konzept ist in der Differential Adhesion Hypothese, die verwendet wurde, um Zellen zu erklären Sortierung Verhalten zwischen embryonalen Keimblatt Gewebe für ^Amphibien-3 und Knochenfische ⁴ Embryonen, für die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Organisation ⁵ und für Zellsortierung zwischen zwei Zellpopulationen identisch i kodifiziertn jeder Hinsicht anders als für die Expression des gleichen Typs von Cadherin ⁽⁶ und Abbildung 4B). Dieses Ergebnis ist besonders wichtig für den Nachweis, wie Engineering einen einfachen Unterschied in der Haftung zwischen Zellpopulationen können bei der Erzeugung von Organstruktur führen, zum Beispiel, ein Inselzellen der Bauchspeicheldrüse ^5.

Abbildung 1. Images von Zellen in hängenden Tropfen Kultur für 18 Stunden entweder in Abwesenheit (A) oder Anwesenheit inkubiert (B) von 25 pm der MEK-Inhibitor PD98059. Die Bilder wurden mit einer digitalen Nikon Eclipse TE 300 Epifluoreszenzmikroskop und Photometrics CoolSnap ES Digitalkamera.

Abbildung 2. Quantifizierung von Meki-induzierte Verdichtung Ratte Prostatakrebs MLL-Zellen. Hanging drop Kulturen von unbehandelten und behandelten Meki MLL-Zellen wurden für 18 Stunden inkubiert, worauf Aggregatgröße wurde bestimmt, wie oben beschrieben. Die statistische Analyse der aggregierten Größe war durch den Student-t-Test. Der Stern steht für einen statistisch signifikanten Unterschied in Körnung (P <0,0001) zwischen unbehandelten und Meki-behandelten Zellen und regt an, Meki-Behandlung führt zu einem deutlich kleineren und kompakteren Aggregaten.

Abbildung 3. Ein Sphäroid durch Inkubation chick embryonalen Leberzellen in hängenden Tropfen Kultur für 18 Stunden dann in einen Inkubator / Schüttelbad für 48 Stunden gebildet. Dieses Bild wurde mit einer digitalen Nikon SMZ800 Stereo-Mikroskop und ein Sony Schwarz CCD-Kamera.

Abbildung 4. Hanging drop Kultur zeigt Aussortieren Verhalten zwischen verschiedenen Zelltypen. In Panel A, wurden chick embryonalen Leberzellen mit PKH-2 Membran interkalierende Farbstoff angefärbt und gemischt zu gleichen Teilen mit PKH-26 gefärbten Küken embryonalen Herzzellen. In Panel B wurden zwei N-Cadherin-transfizierten L-Zell-Klone (LN4 und LN2a), zum Ausdruck N-cad an ihrer Oberfläche im Verhältnis 2,4:1, auch mit dem fluoreszierenden Membran interkalierende Farbstoffe PKH-2 und PKH-26 gefärbten , (Sigma-Aldrich), zu gleichen Teilen gemischt und kultiviert wie hängende Tropfen ^7. Nach 18 Stunden in Kultur wurden Zellschichten zu Schüttelkolben überführt und für weitere 48 Stunden. Aggregate wurden in 2% Paraformaldehyd in festen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und betrachtete mit einem BioRad MRC600 Scanning-Laser-konfokalen Mikroskop-System an einem Nikon Optiphot-2 Mikroskop. Optische Schnitte von beiden grünen und roten Kanälen wurden gesammelt und ein Silicon Graphix purpurnen VGX-Workstation mit Vital Images ausgestattet Voxel anzeigen Ultra-Imaging-Software wurde benutzt, um falsche Farbe auf beiden Kanälen zuordnen und die Bilder verschmelzen und enthüllt die anatomischen Konfigurationen erzeugt. (A) Konfokale optische Schnitt durch ein Aggregat demonstriert Umhüllung der Herzzellen (hier in einer Pseudo-Farbe gelb) von Leberzellen in Falschfarben blau (ab ^8). (B) Konfokale optische Schnitt durch ein Aggregat demonstriert Umhüllung der hohen N-Cadherin-exprimierenden Zellen (grün) von jenen Ausdruck niedrigeren N-Cadherin (rot) (ab ^6).

Discussion

Studien haben gezeigt, dass die Kultivierung von Zellen in einem dreidimensionalen Kontext (3D) unterschiedliche zelluläre Morphologie und Signalisierung, wenn eine starre zweidimensionale (2D) Kultur System ⁹ verglichen produziert. Zum Beispiel zeigen Fibroblasten besiedelten Kollagen-Gelen, die Fibroblasten-Morphologie in 3D ganz verschieden von dem in 2D ^10,11 beobachtet wird. Ebenso können 3D-Kultur induzieren Gewebe-spezifische Differenzierung von Brustepithelzellen. 3D-Kultur-Systeme wurden verwendet, um zwischen normalen und malignen Zellen zu unterscheiden und haben gezeigt, dass die Reversion transformierter Zellen zum normalen Phänotyp zu unterstützen, da die entsprechende Reize ^12,13. Korrekte Gewebe-Architektur wurde auch gezeigt werden, von entscheidender Bedeutung für Langstrecken- Homöostase, die Unterdrückung der Apoptose, und die Wartung der differenzierten Phänotyp der CID-9 Brustepithelzellen ^14. Multizelluläre drug resistance in Maus EMT-6 Mammakarzinom-Zellen hat auch gezeigt, dass in vitro manifestiert werden, wenn Zellen in 3-D-Konfigurationen und nicht in herkömmlichen Monolayerkulturen ¹⁵ angebaut wurden. Diese und andere Daten müssen dem Vorschlag geführt, dass ¹⁶ "die Einheit der Funktion in höheren Organismen weder das Erbgut noch die Zelle allein, sondern das Gewebe selbst ist". Viele andere Methoden zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden vorhanden sind, einschließlich der Verwendung von simulierter Schwerelosigkeit Inkubatoren ¹⁷ und Mikro-Spritzgussteile nicht klebende Hydrogele ^18,19. Im Gegensatz zu diesen Methoden erfordert jedoch die hier beschriebene Methode keine spezielle Ausrüstung oder Reagenzien und ist daher sehr kostengünstig. Die Einfachheit der Methode minimiert potenzielle Fallstricke. Folglich ist die Lernkurve relativ flach und das Verfahren kann leicht innerhalb einer relativ kurzen Zeit bewältigt werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540