Summary
우리는 세포 - 세포 상호 작용의 차이를 수치 3D 조직 같은 spheroids 및 잠재적인 응용 프로그램을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.
Abstract
세포 세포 결합 및 세포 - 하층 부착의 연구는 역사적으로 딱딱한 기판에 점착 성의 monolayer 문화에서 수행되었습니다. 조직 내에서 세포 그러나, 세포는 많은 가까운 이웃과 세포외 기질 구성 요소와 친밀한 연결을 설정하는 밀접하게 포장 조직 내에 대량 일반적으로 쌌다 있습니다. 따라서, 화학 환경 및 3D 조직 내에서 세포에 의해 경험 물리적 강제는 monolayer 문화에서 자란 세포에 의해 경험보다 근본적으로 다릅니다. 이것은 현저하게 세포 형태학 및 신호에 영향을 보여줘왔다. 여러 가지 방법이 콜라겐 젤 1 또는 biomaterial 공사장 공중 발판 2 세포의 캡슐을 포함하여 3 차원 세포 배양을 생성 고안되었습니다. 이러한 방법은 유용하면서 정상 조직에있는 친밀한 직접 세포 세포 접착 아키텍처를 요점을 되풀이하지 않습니다. 오히려, 그들은 더 밀접하게 대략적인 문화 시스템은있는 단일 세포는 느슨하게 ECM 제품의 3D meshwork 이내에 분산됩니다. 여기, 우리는 세포가 드롭 문화 매달려에 배치하고 그들이 세포가 서로와 세포외 기질 구성 요소와 직접 접촉하는 진정한 3D spheroids를 형성 때까지 생리 조건 하에서 incubated하는 간단한 방법을 설명합니다. 방법은 전문적인 장비를 필요로하지 않고 셀 - 셀 또는 셀 ECM 상호 작용에 영향을 elucidating에 관심이있을 것으로 매우 소량의 모든 생물 학적 요원의 추가 포함 적용할 수 있습니다. 방법은 또한 서로 다른 세포 인구가있는만큼 셀 사이의 공간 관계를 지정에서 셀 - 셀 또는 셀 - ECM 상호 작용의 역할을 명료하게하다하는 공동의 문화 두 (또는 그 이상)에 사용할 수 있습니다. 세포 세포 결합 및 세포 - ECM 부착은 악성 침입, 상처 치유, 및 조직 공학에 응용 프로그램을 위해 배아 개발, 종양 - stromal 세포 상호 작용 연구의 기초입니다. 이 간단한 방법은 biomechanical 속성 측정이나 생리학 관련 모델에서 분자와 생화 학적 분석을 위해 세포 집계와 같은 조직을 생성하는 수단을 제공합니다.
Protocol
1. 단일 세포 현탁액의 준비
- 자기편 세포 배양은 90 % 합류로 성장해야 뭘로 monolayers는 PBS로 두 번 씻어서해야합니다. 잘 배수 후, 0.05 % 트립신 - 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 MLS를 (100mm 접시)을 추가하고, 37 품어 ° C를 세포가 분리까지. 전체 중간 2 MLS를 추가하고 부드럽게 세포가 정지 때까지 혼합물을 씹다에 5 ML의 피펫을 사용하여 trypsinization를 중지합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다.
- RT에서 5 분 10 MG / ML DNAse 주식 품어 40 μl를 추가합니다. 5 분 200 XG에 소용돌이 짧게하고 원심 분리기.
- 뜨는 취소 1 ML 전체 조직 문화 매체와 펠렛을 씻으십시오. 반복 후, 전체 조직 문화 매체 2 MLS에 resuspend 세포.
- hemacytometer, 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 카운트 및 2.5 X 10 6 세포 / ML로 농도를 조정합니다. 이 예제에 대한 BioRad TC10 자동 세포 계수기가 사용되었습니다.
2. 공중 드랍스의 형성.
- 60mm 조직 문화 요리와 접시의 바닥에서 개최 PBS 5 MLS을에서 뚜껑을 제거합니다. 이것은 수화 챔버 역할을합니다.
- 뚜껑을 반전하고 뚜껑의 하단에 10 μl 방울을 입금 20 μl pipettor을 사용합니다. 만지지만큼 방울은 너무 충분히 떨어져 배치되었는지 확인합니다. 접시 당 최소한 20 방울을 배치하는 것이 가능합니다.
- 37 PBS - 채워진 바닥 챔버와 부화 ° C / 5 % CO 95분의 2 %의 습도에 뚜껑을 반전 매일 방울 모니터와 세포 시트 또는 집계 중 하나가 형성 때까지 알을 품다. 스테레오 현미경은 집계 형성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
- 일단 시트 양식, 그들이 둥근 바닥 유리 쉐이크로 전송할 수 있습니다 전체 미디어 중 3 MLS가 포함된 37 흔들어 물을 욕조에 incubated flasks ° C와 spheroids 양식까지 5% CO 2.
3. 노트
- 셀 크기에 따라 농도는 위 또는 아래로 조정해야 할 수 있습니다.
- 세포 멤브레인가 걸려 드롭 형성 이전에 형광 염료를 intercalating 물들일 수 있습니다.
- 서로 다른 두 가지 세포 유형이 differentially 매달려 방울의 형성 이전에 1:1 (또는 다른) 비율 스테인드 및 혼합 수 있습니다. 이들은 암, stromal 세포, 배아 조직, 또는 유전적으로 특정 접착제 서명을 가지고 설계 세포 수 있습니다.
- 세포 cadherin 기능을 보존하기 위해 0.05 %의 트립신 / 2 MM의 칼슘을 사용하여 조직 문화 요리에서 분리 수 있습니다.
- 실험에 따라 시트 크기는 어느 측정할 수있다, 또는 집계는 기계적 시험 또는 생화 학적 또는 분자 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
시트 또는 회전 타원체 형성은 일반적으로 24 시간 이내에 발생하지만 세포 유형에 따라 더 오래 걸릴 수도 있습니다. 그림 1은 치료 전립선암 MAT - LyLu (MLL) 드롭 문화를 걸려의 세포 (그림 1A) 또는 25 μm의 MEK 억제제 PD98059로 치료 세포의 배양 18 시간 후 촬영한 이미지를 나타냅니다. 세포 시트의 표시 압축에 MEKi 처리 결과를 참고. 압축은 10-20의 크기 (또는 이상) 방울에 걸려 치료 그룹 사이의 평균 크기를 비교 측정하여 계량하실 수 있습니다. 우리는 픽셀의 전체 이미지 영역을 나타내기 위해 입자 분석을 적용 뭘로 우리는 일반적으로 이진 모드로 이미지를 다음 각 이미지를 thresholding 변환하여 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다. 이것은 그때 쉽게 평방 미크론으로 변환할 수 있습니다. 그림 2는 치료와 MEKi - 대우 MLL 세포의 크기 비교를 나타냅니다. 학생의 T - 테스트 (P는 <0.0001)에 의해 비교처럼 언급, MEKi 치료는 크게 시트 크기를 줄일 수 있습니다. 이 비교를 위해, 치료 및 치료 세포의 각 10 집계가 측정되었다. 그림 3은 드롭 문화를 걸려 24 시간 쉐이크 목욕 2 일 후에 형성된 여자 배아 간 회전 타원체를 나타냅니다.
매달려 드롭 분석도 공간적 위치가 채택 나타내기 위해 하나 이상의 셀 유형을 포함하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 병아리 배아 간세포는 형광 막 - intercalating 염색 물들일하고 다른 형광 마커 물들일되었습니다 여자는 배아 심장 세포와 혼합, 격리 수 있습니다. 대신 나머지보다 intermixed되는 그림 4A 쇼, 간, 심장 세포가 한 다른에서 "정렬 아웃"하는 경향과 채택 영역 - 내 - 어 - 구형의 심장 세포가 간 세포에 의해 싸여있는 구성. 이 구성은 간장과 심장 세포 사이의 세포 접착의 차이에 의해 설명하실 수 있습니다. 이 개념은 췌장 아일릿 세포 조직 5와 세포가 동일한 I이 세포 집단 사이의 정렬, 수륙 양용 3 teleost 4 배아의 배아 배아 계층 조직 사이의 동작을 정렬 세포를 설명하는 데 사용되었습니다 차동 접착 가설에 codified입니다N cadherin (6 그림 4B)의 같은 종류의 표현 수준 이외의 모든 존중합니다. 이 결과는 세포 집단 사이의 접착에 간단한 변화를 기술하는 방법 보여주는 경우에 특히 중요한 것은 예를 들어, 장기 구조의 생성을 초래할 수, 췌장 아일릿 5.
그림 1.하거나 부재 (A) 또는 앞에서 18 시간 동안 드롭 문화를 걸려에서 incubated 세포의 이미지 (B) MEK 억제제 PD98059 25 μm의 중. 이미지는 니콘 이클립스 TE 300 epifluorescence 현미경 및 Photometrics CoolSnap ES 디지털 카메라를 사용하여 캡처한되었습니다.
그림 2. 쥐의 전립선 암 세포의 MLL MEKi 유발 압축의 양을 정함. 위에서 설명한대로 집계 크기가 결정되었습니다 뭘로 치료 및 MEKi - 대우 MLL 세포 매달려 놓기 문화가 18 시간 동안 incubated되었습니다. 골재 크기의 통계적 분석은 학생의 T - 테스트로했다. 별표 상당히 더 작고 컴팩트 집계에 치료 및 MEKi - 치료 세포 및 제안 MEKi - 치료 결과 사이의 집합 크기에 통계적으로 의미 차이 (P는 <0.0001)을 나타냅니다.
그림 3. 인큐베이터에서 다음 18 시간 동안 드롭 문화를 걸려 / 48 시간 동안 목욕을 흔들어에 여자는 배아 간세포 잠복기에 의해 형성 회전 타원체. 이 이미지는 니콘 SMZ800 스테레오 현미경과 소니 블랙 CCD 카메라를 사용하여 캡처한되었습니다.
그림 4. 드롭 문화 식이란 다른 세포 유형 간의 행동 아웃 정렬 보여줍니다. 패널에서이 병아리 배아 간세포는 PKH - 2 막 intercalating 염색 물들일되었으며 PKH - 26 묻은 여자는 배아 심장 세포와 같은 비율로 혼합. 패널 B에서는 2.4:1의 비율에서 표면에 N - CAD 표현이 N - cadherin - transfected L 세포 클론은 (LN4 및 LN2a), 또한 형광 막 intercalating 염료 PKH - 2 및 PKH - 26 물들일되었습니다 (시그마 - 알드리치), 동등한 비율로 혼합하여 방울 7 걸려으로 교양. 문화 18 시간 후, 세포 시트 떨고 flasks로 전송된 다른 48 시간 동안 incubated. 집계가의 2 % paraformaldehyde에서 수정되었습니다 생리 인산염 버퍼와 니콘 Optiphot - 2 현미경에 부착된 BioRad MRC600 스캐닝 레이저 공촛점 현미경 시스템을하셨습니다. 녹색과 적색 두 채널의 광학 부분이 수집되었으며 바이탈 이미지를 갖춘 실리콘 Graphix 크림슨 VGX 워크 스테이션은 Voxel보기 울트라 이미징 소프트웨어는 생성된 해부 구성을 공개, 두 채널에 잘못된 색상을 지정하고 이미지를 병합하는 데 사용되었습니다. (A) pseudocolor 파란색으로 간세포 (8)에 의해 심장 세포의 집합 보여주는 봉함을 통해 공촛점 광학과 (여기 의사 - 색상 노란색). N - cadherin (적색) (6)의 낮은 수준을 표현하는 사람들에 의해 높은 N - cadherin 표현 전지 (녹색)의 집계 보여주는 봉함을 통해 (B) 공촛점 광학 섹션을 참조하십시오.
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Discussion
연구는 3 차원 컨텍스트 (3D)에 culturing 세포는 독특한 세포 형태학 및 엄격한 2 차원 (2D) 문화 시스템 9 비교할 때 신호를 생성하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, fibroblast - 인구 콜라겐 젤는 3D에서 fibroblast의 형태는 2D 10,11에서 관찰와는 상당히 별개의 것을 보여줍니다. 마찬가지로, 3D 문화는 내유 상피 세포의 조직과 관련된 차별을 일으킬 수. 3D 문화 시스템은 정상 및 악성 세포를 구분하는 데 사용되었으며 정상 표현형로 변형 세포의 복귀를 지원하기 위해 표시되었습니다, 적절한 자극 12,13 주어. 올바른 조직 구조도 장거리를 위해 필수적인 것으로 표시되었습니다 항상성, apoptosis의 억제, 그리고 CID - 9 내유 상피 세포 14 차별 표현형의 유지. 전지가 기존의 monolayer 문화 15 3 - D 구성 및되지 성장했다 경우에만 마우스 다세포 약물 저항은 EMT - 6 내유 암종 세포는 체외에서 나타나신 것으로 표시되었습니다. 이들 및 기타 데이터는 16 "이상의 생물에서 기능의 단위는 게놈이나 혼자 세포하지만, 조직 자체도는"그 제안에 LED가 있습니다. 3D spheroids를 생성하는 많은 다른 방법은 시뮬레이션 microgravity의 incubators 17 및 마이크로 성형이 아닌 접착 hydrogels 18,19의 사용을 포함하여, 존재합니다. 이러한 방법과는 달리 단, 여기서 설명하는 방법은 전문적인 장비 또는 시약이 필요 없으므로 매우 비용 효과적입니다. 방법의 단순 잠재적인 함정을 최소화합니다. 따라서, 학습 곡선은 비교적 얕은이며, 방법은 시간의 비교적 짧은 기간 내에 쉽게 마스터하실 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원을 위해 박사 Dongxuan 지아 감사하고 싶습니다. 이 문서에 나타나는 이미지 중 일부는 박사 말콤 S. 스타 인 버그, 분자 생물학의학과, 프린스턴 대학교와 공동으로했다. 저자는 또한 국방 전립선암 연구 프로그램 (보조금 PC - 030482와 PC - 991552)의 계열 NCI / NIH (부여 R01CA118755)은 관대한 지원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic cell counter | Bio-Rad | TC10 | |
| shaking water bath with CO2 gable cover | Labline Instruments | 3540 |
References
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