一个简单的悬滴细胞生成三维球体文化协议

Summary

我们描述了一个简单快速的方法，生成三维组织类似的球体和其潜在的应用，量化，在细胞间的相互作用的差异。

Abstract

壁刚性基板上单层培养的细胞与细胞间的凝聚力和基质细胞黏附的研究在历史上一直执行。然而，一个组织内的细胞，通常装在一个紧密排列的组织肿块，在其中的细胞建立亲密的联系，许多附近的邻居和细胞外基质成分。因此，化学环境和一个三维组织内的细胞所经历的物理力量比单层培养细胞生长经历的根本不同。这已经显示出显着影响细胞的形态和信号。已制定了几种方法生成的三维细胞培养物，包括细胞^在胶原凝胶1或^生物材料支架2封装。这样的方法，虽然有用，但不复述亲密直接的细胞与细胞间的粘附结构，在正常组织中发现。相反，他们更加紧密地近似的文化系统中，单个细胞松散地分散在一个3D小梁ECM产品。在这里，我们描述了一个简单的方法中，细胞被放置在悬滴培养和生理条件下培养，直到它们形成真正的3D球体中，细胞直接接触与相互之间以及与细胞外基质成分。该方法无需专门的设备，可适应包括在非常小的数量，阐明对细胞与细胞或细胞- ECM相互作用的影响可能感兴趣的任何生物制剂此外。该方法也可用于共培养两个（或更多），不同的细胞群，以澄清在指定细胞之间的空间关系中的作用的细胞 - 细胞或细胞外基质的相互作用。细胞与细胞间的凝聚力和细胞- ECM的粘附，胚胎发育，肿瘤的间质细胞相互作用恶性侵袭，促进伤口愈合，组织工程的应用研究的基石。这个简单的方法将提供一个样组织产生的生物力学性能的测量或细胞聚集在生理相关的模型的分子和生化分析的手段。

Protocol

1。单细胞悬液的制备

1. 于是单层贴壁细胞培养应增长到90％汇合，应当用PBS漂洗两次。排水良好后，加入2毫升，0.05％胰蛋白酶1毫米EDTA（100毫米板块），并在37 ° C，直到细胞分离。停止加入2 MLS的完全培养基，轻轻地用5毫升吸管磨碎的混合物，直至细胞悬浮液中的胰蛋白酶。细胞转移到15毫升锥形管。
2. 添加在室温为5分钟40μL10 mg / ml的DNA酶股票和孵化。涡短暂离心5分钟，在200的XG。
3. 弃上清，用1毫升完整的组织培养基颗粒。重复，然后在2 MLS的完整的组织培养液中的悬浮细胞。
4. 计数细胞，使用hemacytometer，或自动细胞计数，调整浓度为2.5 × ¹⁰ 6细胞/ ml 。对于本演示一个BioRad公司TC10自动细胞计数器使用。

2。形成悬滴。

1. 删除从60毫米组织培养皿并将其放置在底部的菜5毫升的PBS的盖子。这将作为一个水化室。
2. 倒置的盖子，并用20μL移液器存款10μL滴上的盖子底部。确保，滴放置足够的距离，以不碰。这是可能的地方至少有20％菜滴。
3. 反转到的PBS填充的底部室和孵化在37 ° C / 5％的_CO 2 / 95％湿度盖子，监察滴每天孵育直到细胞表或聚集已经形成。一个立体显微镜可用于评估汇总形成。
4. 一旦表的形式，他们可以转移到圆底玻璃振动筛瓶含有3 MLS和完全培养基在摇晃水浴孵育37 ° C和5％，直到球体形成的CO _2。

3。注释

1. 根据细胞的大小，浓度可能需要向上或向下调整。
2. 可染细胞与膜插层荧光染料前悬滴形成。
3. 两种不同的细胞类型可以不同的染色和前悬滴的形成1:1的比率（或其他）混合。这些可以成为癌症和基质细胞，胚胎组织或细胞基因工程有特定的粘合剂签名。
4. 用0.05％胰酶/ 2毫米的钙，以维持钙粘蛋白功能，细胞可以脱离组织培养皿。
5. 根据实验，表的大小可以衡量，或聚合，可用于机械试验或生化或分子分析。

4。代表性的成果：

表“或”球体的形成通常发生在24小时内，但可能需要更长的时间取决于细胞类型。图1代表未经治疗的前列腺癌的MAT - LyLu（MLL）细胞在悬滴文化（图1A）或25微米MEK抑制剂PD98059处理的细胞培养18小时后拍摄的图像。请注意，在标记的细胞表压实MEKi的治疗效果。压实是可以量化的测量大小为10-20（或更多）挂滴和治疗组之间的平均规模比较。我们通常使用阈值每一个图像，然后将图像转换为二进制模式ImageJ软件分析图像，于是我们申请颗粒分析，以揭示总像素的图像区域。这可以很容易地转换为平方微米。图2表示了未处理和治疗MEKi MLL基因细胞的大小比较。如前所述，MEKi治疗，大大降低了学生的t检验（P <0.0001）相比，纸张尺寸。对于这种比较，分别测定了10个未处理和处理过的细胞聚集。图3表示一个鸡胚肝悬滴培养24小时，2天在摇床浴后形成的球体。

悬滴检测，也可以修改，以包括一个以上的细胞类型，揭示空间定位通过。例如，可以是孤立的，鸡胚肝细胞，用荧光膜插层染料染色，用鸡胚胎的心脏细胞已用不同的荧光标记染色混合的。图，而不是剩余混合4A显示，肝脏和心脏细胞往往从一个“排序”，并采取一个领域内的一个领域配置，其中心脏细胞，肝细胞弥漫。此配置可通过细胞间粘附在肝脏和心脏细胞之间的差异解释。这个概念是编纂差速贴壁的假说已被用来解释细胞为胰岛细胞^组织 5和细胞之间的细胞群相同的I排序排序^两栖动物 3和硬骨^鱼类 4胚胎的胚层组织之间的行为，ñ每一个方面比其他为钙粘蛋白^（6和图4B）同一类型的表达水平。这个结果显得尤为重要示范工程在细胞群之间的附着力的简单的差异如何，可能会导致器官结构^的产生，例如，胰岛5。

图1。挂18小时，无论是在下降的情况下（A）或存在文化细胞的图像（二）的MEK抑制剂PD98059 25微米。使用尼康的Eclipse TE 300 epifluorescence显微镜和Photometrics CoolSnap ES数码相机捕获图像。

图2。MEKi诱导大鼠前列腺癌的MLL细胞压实的量化。悬滴文化的未经处理和MEKi处理的MLL细胞培养18小时，届时总的大小是决定如上所述。骨料粒径的统计分析是由学生的t -检验。星号代表在骨料粒径之间的未经处理和MEKi处理的细胞和建议，MEKi治疗效果显着性差异明显变小，更紧凑的聚合性（P <0.0001）。

图3。挂18小时，然后在下拉文化的孵化器/惊天48小时洗澡孵化鸡胚肝细胞形成一个球体。使用尼康SMZ800立体显微镜和索尼黑色CCD相机拍摄图像。

图4。悬滴文化，揭示出不同类型的细胞之间的行为进行排序。在A组中，鸡胚肝细胞PKH - 2插层膜染料染色和混合PKH - 26染色小鸡胚胎的心脏细胞的比例相等。在B组中，两个N - cadherin的转染L细胞克隆（LN4和LN2a），在2.4:1的比例在其表面表达的N - CAD，也沾上插层染料的荧光膜PKH - 2和PKH - 26 （Sigma - Aldrich公司），混合比例相等和悬滴⁷培养。文化在18小时后，细胞表转移到摇瓶和孵育48小时。总量在2％多聚甲醛固定在磷酸缓冲液和一个BioRad公司MRC600激光扫描共聚焦显微镜系统连接到尼康Optiphot - 2显微镜观看。 （一）从绿色和红色通道的光学部分收集和硅谷Graphix公司深红VGX工作站，配备了生命图像体素查看超成像软件用于分配两个通道假彩色，并合并图像，揭示了产生的解剖配置。共焦光学部分（这里是一个伪彩色黄色）通过聚合证明心脏细胞的包围伪蓝色的肝^细胞 （8 ）。 （二）共焦光学部分通过N - cadherin的高表达细胞表达水平较低的N - cadherin的（红色^{）（6）（}绿色）的总展示包络。

Discussion

有研究表明，在三维环境（3D）培养细胞产生不同的细胞形态和信号时相比，一个刚性的二维（2D）文化^系统 9 。例如，成纤维细胞填充的胶原凝胶表明，成纤维细胞在三维形态是相当^独特的2D 10,11指出的。同样，三维培养可诱发乳腺上皮细胞分化的组织特异性。已被用来区分正常和恶性细胞三维培养系统，并已表明支持转化细胞的表型正常的回归，给予适当的刺激^12,13。正确的组织架构也被证明是远距离的关键动态平衡，抑制细胞凋亡，并维护CID ​​- 9 ¹⁴乳腺上皮细胞的差异表型。多细胞耐药小鼠EMT - 6乳腺癌细胞也被证明在体外的表现，只有当细胞生长在3 - D的配置和^传统的单层培养15。导致这些数据和其他数据的建议，“在高等生物中的功能单位是没有的基因组单独的单元格，但组织本身^”16 。存在许多其他方法生成三维球体，包括使用模拟微重力孵化^器 17和微成型无涂胶^水凝胶18,19。但这些方法不同，这里所描述的方法，不需要专门的设备或试剂，因此极具成本效益。简单的方法，最大限度地减少了潜在的隐患。因此，学习曲线相对较浅，该方法可以轻松地在一个相对较短的时间内掌握。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540