Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Summary

Descriviamo un metodo semplice, rapido di generare 3D tessuti come sferoidi e la loro potenziale applicazione di quantificare le differenze nelle interazioni cellula-cellula.

Abstract

Studi di cellula-cellula di coesione e adesione cellula-substrato sono storicamente stati effettuati su colture monostrato aderente a substrati rigidi. Cellule all'interno di un tessuto, però, sono in genere racchiusi all'interno di una massa di tessuto stipati in cui le cellule stabilire connessioni intime con molti quasi vicini di casa e con componenti della matrice extracellulare. Di conseguenza, l'ambiente chimico e le forze fisiche sperimentato da cellule all'interno di un tessuto 3D sono fondamentalmente diversi da quelli vissuti da cellule cresciute in coltura monostrato. Questo è stato dimostrato che l'impatto notevolmente la morfologia cellulare e di segnalazione. Diversi metodi sono stati studiati per generare colture di cellule 3D tra cui l'incapsulamento di cellule in gel di collagene ¹ o in biomateriale impalcature ^2. Tali metodi sono utili, ma non ricapitolare l'intimo diretto cellula-cellula architettura di adesione si trovano in tessuti normali. Piuttosto, più da vicino i sistemi di coltura approssimativi in ​​cui le cellule singole sono liberamente disperso all'interno di un reticolo 3D di prodotti ECM. Qui, descriviamo un semplice metodo in cui sono inserite cellule in sospensione cultura goccia e incubate in condizioni fisiologiche fino a formare veri sferoidi 3D in cui le cellule sono in contatto diretto con loro e con i componenti della matrice extracellulare. Il metodo non richiede attrezzature specializzate e può essere adattato per includere l'aggiunta di alcun agente biologico in quantità molto piccole che possono essere di interesse per chiarire gli effetti sulla cellula-cellula o cellula-ECM interazione. Il metodo può essere utilizzato anche per co-coltura due (o più) diverse popolazioni cellulari in modo da chiarire il ruolo di cellula-cellula o cellula-ECM interazioni nello specificare le relazioni spaziali tra le celle. Cellula-cellula e cellula-coesione ECM adesione sono i cardini di studi di sviluppo embrionale, tumore stromale interazione cellula maligna invasione, la guarigione delle ferite, e per applicazioni di ingegneria dei tessuti. Questo semplice metodo fornirà un mezzo per generare tessuti come aggregati cellulari per la misurazione di proprietà biomeccaniche o per l'analisi molecolari e biochimici in un modello fisiologicamente rilevanti.

Protocol

1. Preparazione di una sospensione singola cella

1. Colture di cellule aderenti dovrebbe essere cresciuta al 90% di confluenza, monostrati dopo di che devono essere risciacquati due volte con PBS. Dopo aver svuotato bene, aggiungere 2 ml (per 100 piastre mm) del 0,05% tripsina-1 mM EDTA, e incubare a 37 ° C fino a staccare le cellule. Fermare tripsinizzazione aggiungendo 2 ml di terreno completo e delicatamente utilizzare un pipetta da 5 ml per triturare il composto fino a quando le cellule sono in sospensione. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml.
2. Aggiungere 40 ml di un 10 mg / ml di DNAsi fotografici e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Vortex brevemente e centrifugare a 200 xg per 5 minuti.
3. Gettare il surnatante e lavare pellet con 1 media tessuto completo cultura ml. Ripeto, poi risospendere le cellule in 2 ml di terreno completo coltura dei tessuti.
4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzati e regolare la concentrazione di 2,5 x 10 ⁶ cellule / ml. Per questa dimostrazione uno TC10 contatore di cellule BioRad automatizzato è stato usato.

2. Formazione di gocce.

1. Togliere il coperchio da un piatto tessuto 60 millimetri cultura e luogo 5 ml di PBS sul fondo del piatto. Questo fungerà da camera di idratazione.
2. Invertire il coperchio e utilizzare un pipettatore 20 microlitri di depositare 10 gocce microlitri sul fondo del coperchio. Assicurarsi che gocce sono posti sufficientemente distanziati in modo da non toccare. E 'possibile mettere almeno 20 gocce al piatto.
3. Invertire il coperchio sulla PBS camera piena basso e incubare a 37 ° C / 5% di CO ₂ / 95% di umidità, monitorare le gocce giornaliere e incubare fino a quando i fogli di cellule o aggregati si sono formati. Un microscopio stereo può essere utilizzato per valutare la formazione di aggregati.
4. Una volta forma fogli, essi possono essere trasferiti a fondo rotondo in vetro shaker palloni contenenti 3 ml di terreno completo e incubate in un bagno d'acqua agitazione a 37 ° C e 5% di CO ₂ fino a formare sferoidi.

3. Note

1. A seconda delle dimensioni delle cellule, la concentrazione potrebbe essere necessario essere regolata verso l'alto o verso il basso.
2. Cellule possono essere colorate con tinture fluorescenti membrana intercalando prima formazione delle gocce sospese.
3. Due diversi tipi di cellule possono essere differentemente colorate e mescolato in una (o altro) rapporto di 1:1 prima formazione di gocce. Questi possono essere cellule tumorali e stromali, tessuti embrionali, o cellule geneticamente modificate per avere firme adesivo specifico.
4. Le celle possono essere staccato dai piatti coltura di tessuti con tripsina 0,05% / 2 di calcio mM di preservare la funzione caderina.
5. A seconda della sperimentazione, le dimensioni del foglio può essere misurato, o aggregati può essere utilizzato per il test meccanici o per analisi biochimiche o molecolari.

4. Rappresentante dei risultati:

Foglio o la formazione di sferoide si verifica in genere entro 24 ore, ma può richiedere più tempo a seconda del tipo di cellula. La figura 1 rappresenta le immagini catturate dopo 18 ore di incubazione del tumore della prostata non trattati MAT-LyLu (MLL), le cellule in coltura appeso calo (Figura 1A) o cellule trattate con 25 micron MEK inibitori PD98059. Si noti che il trattamento con Meki in una marcata compattazione dello strato di cellule. La compattazione può essere quantificata misurando le dimensioni di 10-20 (o più) appesi gocce dimensione media e il confronto tra i gruppi di trattamento. Noi di solito analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ dalla soglia ogni immagine poi la conversione di immagini in modalità binaria, dopo di che applicare l'analisi delle particelle per rivelare la superficie totale dell'immagine in pixel. Questo può essere facilmente convertito in micron quadrati. La figura 2 rappresenta un confronto dimensioni per le cellule non trattate e Meki MLL-trattati. Come notato, il trattamento Meki riduce significativamente formato del foglio rispetto da parte di Student t-test (p <0,0001). Per questo confronto, 10 aggregati per ciascuna delle cellule non trattate e trattate sono state misurate. Figura 3 rappresenta un embrionale sferoide fegato pulcino formato dopo 24 ore di sospensione cultura goccia e 2 giorni in un bagno shaker.

Il dosaggio goccia può anche essere modificato per includere più di un tipo di cellule per rivelare il posizionamento spaziale adottato. Per esempio, le cellule del fegato pulcino embrionali possono essere isolate, tinto con un fluorescente membrana intercalando colorante e mescolate con cellule del cuore pulcino embrionali che sono stati colorati con un marcatore fluorescente diversa. Mostra la figura 4A che piuttosto che rimanere mescolati, le cellule del fegato e il cuore tendono a "sort-out" da un altro e adottare una sfera-in-a-sfera di configurazione in cui le cellule del cuore sono avvolti dalle cellule del fegato. Questa configurazione può essere spiegata da differenze di adesione intercellulare tra fegato e cellule del cuore. Questo concetto è codificato nella ipotesi Adesione differenziale che è stato usato per spiegare il comportamento delle cellule di smistamento tra il tessuto embrionale foglietto embrionale per anfibi teleostei ³ e ⁴ embrioni, per l'organizzazione delle cellule delle isole pancreatiche ⁵ e per l'ordinamento delle cellule tra due popolazioni di cellule identiche in ogni punto di vista diverso per i livelli di espressione dello stesso tipo di caderina ⁽⁶ e Figura 4B). Questo risultato è particolarmente importante per dimostrare come ingegneria una semplice differenza di adesione tra popolazioni di cellule può portare alla generazione di struttura degli organi, per esempio, un isole pancreatiche ^5.

Figura 1. Immagini di cellule incubate in sospeso cultura goccia per 18 ore sia in assenza (A) o presenza (B) del 25 micron della inibitore MEK PD98059. Le immagini sono state catturate con una Nikon Eclipse TE 300 e un microscopio a epifluorescenza fotometrici CoolSnap ES fotocamera digitale.

Figura 2. Quantificazione di Meki indotta compattazione delle cellule tumorali della prostata di ratto MLL. Culture goccia di cellule non trattate e MLL Meki trattati sono stati incubati per 18 ore dopo di che dimensioni aggregato è stato determinato come sopra descritto. L'analisi statistica della dimensione aggregata era di Student t-test. L'asterisco rappresenta una differenza statisticamente significativa nelle dimensioni aggregate (P <0,0001) tra le cellule non trattate e trattate con Meki e suggerisce che Meki-trattamento si traduce in aggregati molto più piccoli e compatti.

Figura 3. Formata da uno sferoide incubando cellule del fegato embrionale pulcino in sospeso cultura goccia per 18 ore poi in un incubatore / agitazione bagno per 48 ore. Questa immagine è stata catturata usando un microscopio stereo SMZ800 Nikon e Sony Nero camera CCD.

Figura 4. Hanging cultura goccia rivela ordinamento-out comportamento tra diversi tipi di cellule. Nel pannello A, le cellule del fegato pulcino embrionali sono state colorate con PKH-2 membrana colorante intercalante e miscelati in proporzioni uguali con PKH-26 macchiato le cellule del cuore pulcino embrionali. Nel pannello B, due N-caderina transfettate cloni cellulari L (LN4 e LN2a), esprimendo N-cad a loro superficie nel rapporto di 2.4:1, sono stati colorati con le tinte fluorescenti membrana intercalando PKH-2 e PKH-26 , (Sigma-Aldrich), miscelati in proporzioni uguali e colto come appendere gocce ^7. Dopo 18 ore di cultura, fogli cellulari sono stati trasferiti in fiasche agitazione e incubate per altre 48 ore. Aggregati sono stati fissati nel 2% paraformaldeide in PBS e visualizzati con un BioRad MRC600 sistema di scansione laser confocale microscopio collegato a un Optiphot-2 microscopio Nikon. Sezioni ottiche da entrambi i canali verde e rosso sono stati raccolti e una Silicon Graphix Crimson VGX postazione di lavoro dotata di Vital Images Voxel Ultra View software di imaging è stato utilizzato per assegnare i falsi colori per entrambi i canali e di unire le immagini, rivelando le configurazioni anatomiche generato. (A) confocale sezione ottica attraverso un avvolgimento aggregato dimostrazione delle cellule del cuore (qui in uno pseudo-colore giallo) da parte delle cellule del fegato in pseudocolori blu (da ^8). (B) sezione confocale ottico attraverso un avvolgimento aggregato dimostrando di alta N-caderina cellule che esprimono (verde) da parte di coloro che esprimono bassi livelli di N-caderina (rosso) (da ^6).

Discussion

Gli studi hanno dimostrato che le cellule in coltura tridimensionale contesto (3D) produce distinte morfologia cellulare e di segnalazione rispetto ad un rigido bidimensionale (2D) sistema cultura ^9. Per esempio, fibroblasti popolate gel collagene dimostrare che la morfologia dei fibroblasti in 3D è ben distinta da quella osservata in 2D ^10,11. Allo stesso modo, la cultura 3D può indurre tessuto-specifica differenziazione delle cellule epiteliali mammarie. Sistemi di coltura 3D sono stati utilizzati per distinguere tra cellule normali e maligni e hanno dimostrato di sostenere il ritorno delle cellule trasformate a fenotipo normale, dato lo stimolo appropriato ^12,13. Architettura del tessuto corretto è anche dimostrato di essere vitale per il lungo raggio omeostasi, la soppressione di apoptosi, e il mantenimento del fenotipo differenziato delle CID-9 cellule epiteliali mammarie ^14. Resistenza ai farmaci pluricellulari nel topo EMT-6 cellule di carcinoma mammario è stato anche dimostrato di essere manifestata in vitro solo se le cellule sono state coltivate in configurazioni 3-D e non in colture monostrato convenzionale ^15. Questi ed altri dati hanno portato alla proposta che "l'unità di funzione negli organismi superiori non è né il genoma della cellula, né da solo, ma il tessuto stesso" ^16. Molti altri metodi di generazione di sferoidi 3D esistenti, compreso l'uso di incubatori microgravità simulata ^17, e micro-stampato non adesivo idrogel ^18,19. A differenza di questi metodi però, il metodo qui descritto non richiede attrezzature specializzate o reagenti ed è quindi molto conveniente. La semplicità del metodo minimizza potenziali insidie. Di conseguenza, la curva di apprendimento è relativamente poco profondo e il metodo può essere imparato facilmente in un periodo di tempo relativamente breve.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540