Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Summary

Se describe un método simple, rápido de generación de 3D, como los tejidos esferoides y su potencial aplicación para cuantificar las diferencias en las interacciones célula-célula.

Abstract

Los estudios de la cohesión célula-célula y la adhesión célula-sustrato históricamente han llevado a cabo en cultivos de monocapa adherida a sustratos rígidos. Las células en un tejido, sin embargo, suelen ser encerrado dentro de una masa de tejido muy juntos en el cual las células establecer conexiones íntimas con muchos casi vecinos y con componentes de la matriz extracelular. En consecuencia, el entorno químico y físico experimentado por las fuerzas de las células en un tejido 3D son fundamentalmente diferentes de las experimentadas por las células cultivadas en cultivo en monocapa. Esto se ha demostrado que el impacto notablemente la morfología celular y la señalización. Varios métodos han sido diseñados para generar culturas de células en 3D incluyendo encapsulación de células en geles de colágeno o ^un biomaterial en andamios ^2. Estos métodos, aunque útiles, no recapitulan la íntima directa célula-célula arquitectura de adhesión se encuentra en los tejidos normales. Por el contrario, más de cerca los sistemas de aproximación de la cultura en la que las células individuales están más o menos dispersas dentro de una malla 3D de productos de ECM. Aquí se describe un método simple en el cual las células se colocan en la cultura colgantes caída y se incubaron en condiciones fisiológicas, hasta que la verdadera forma de esferoides 3D en el que las células están en contacto directo con ellos y con componentes de la matriz extracelular. El método no requiere equipo especializado y puede ser adaptado para incluir la adición de cualquier agente biológico en cantidades muy pequeñas que pueden ser de interés en el esclarecimiento de los efectos en la célula-célula o la interacción célula-ECM. El método también puede utilizarse para el co-cultivo de dos (o más) de diferentes poblaciones de células con el fin de dilucidar el papel de las interacciones célula-célula o célula-ECM en la especificación de las relaciones espaciales entre las células. Célula-célula la cohesión y la adhesión célula-ECM son los pilares de los estudios de desarrollo embrionario, la interacción, las células tumorales del estroma en la invasión maligna, la cicatrización de heridas, y para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Este sencillo método proporcionará un medio de generar tejido como agregados celulares para la medición de las propiedades biomecánicas o para el análisis molecular y bioquímico en un modelo fisiológicamente relevantes.

Protocol

1. Preparación de una suspensión de células individuales

1. Adherente culturas de células deben ser cultivadas a 90% de confluencia, las monocapas con lo cual se deben enjuagar dos veces con PBS. Después de drenar bien, añadir 2 ml (para placas de 100 mm) de la tripsina-1 0.05% mM EDTA y se incuba a 37 ° C hasta que las células separar. Dejar de tripsinización mediante la adición de 2 ml de medio completo y con cuidado el uso de una pipeta de 5 ml para triturar la mezcla hasta que las células están en suspensión. La transferencia de células a un tubo cónico de 15 ml.
2. Añadir 40 ml de un 10 acciones mg / ml DNAsa e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vortex brevemente y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos.
3. Desechar el sobrenadante y lavar pellet con 1 ml de medio completo de cultivo de tejidos. Repito, pues suspender las células en 2 ml de medio completo de cultivo de tejidos.
4. Contar las células con un hemocitómetro, o contador celular automático y ajustar la concentración de 2,5 x 10 ⁶ células / ml. Para esta demostración un BioRad TC10 contador celular automático fue utilizado.

2. Formación de gotas colgantes.

1. Quite la tapa de un plato de cultivo de tejidos de 60 mm y colocar 5 ml de PBS en el fondo del plato. Esto actúa como una cámara de hidratación.
2. Invertir la tapa y el uso de una pipeta de 20 l de depósito l 10 gotas en la parte inferior de la tapa. Asegúrese de que las gotas se colocan lo suficientemente separados para que no toque. Es posible colocar al menos 20 gotas por plato.
3. Invertir la tapa sobre el PBS cámara llena de fondo y se incuba a 37 ° C / 5% CO ₂ / 95% de humedad, controlar las gotas todos los días y se incuban hasta que las hojas de células o grupos, se han formado. Un microscopio estéreo se puede utilizar para evaluar la formación de agregados.
4. Una vez que forman las hojas, que pueden ser transferidos a fondo redondo coctelera frascos que contienen 3 ml de medio completo y se incubaron en un baño de agua agitando a 37 º C y 5% de CO ₂ hasta que se formen esferoides.

3. Notas

1. Dependiendo del tamaño de la célula, la concentración puede ser necesario ajustar hacia arriba o hacia abajo.
2. Las células pueden ser teñidas con colorantes fluorescentes membrana intercalar antes de la formación de gota.
3. Dos diferentes tipos de células pueden ser diferenciada de colores y mezclados en una relación 1:1 (u otros) la relación antes de la formación de gotas colgantes. Estas pueden ser las células del cáncer y del estroma, tejidos de embriones o células manipuladas genéticamente para tener firmas específicas adhesivo.
4. Las células pueden separarse de los platos de cultivo de tejidos con 0,05% de tripsina / 2 mM de calcio para preservar la función cadherina.
5. Dependiendo del experimento, los tamaños de hoja pueden ser medidos, o agregados pueden ser utilizados para los ensayos mecánicos o para el análisis bioquímico y molecular.

4. Los resultados representativos:

Hoja o la formación de esferoides se produce normalmente dentro de las 24 horas, pero puede tomar más tiempo dependiendo del tipo de célula. La figura 1 representa las imágenes capturadas después de 18 horas de incubación de tratar el cáncer de próstata LyLu MAT (MLL), las células en la cultura colgantes caída (Figura 1) o las células tratadas con 25 micras inhibidor de MEK PD98059. Tenga en cuenta que los resultados del tratamiento Meki en una compactación marcada de la capa celular. La compactación se puede cuantificar midiendo el tamaño de 10-20 (o más) que cuelgan gotas y la comparación de tamaño medio entre los grupos de tratamiento. Por lo general analizar las imágenes utilizando el software ImageJ umbral por cada imagen a continuación, convertir imágenes a modo binario, con lo cual se aplica el análisis de partículas para revelar el área total de la imagen en píxeles. Esto puede ser fácilmente convertido en micrones cuadrados. La Figura 2 representa una comparación de tamaño de las células no tratadas y Meki MLL tratados. Como se ha indicado, el tratamiento Meki reduce significativamente el tamaño de hoja, en comparación con la t de Student-test (P <0,0001). Para esta comparación, 10 agregados para cada una de las células tratadas y no tratadas se midieron. La figura 3 representa un esferoide de pollo hígado embrionario formado después de 24 horas en colgar la cultura de caída y dos días en un baño de agitación.

La prueba de gota también puede ser modificado para incluir más de un tipo de células para revelar el posicionamiento espacial adoptada. Por ejemplo, las células de embriones de pollo de hígado puede ser aislado, se tiñeron con un fluorescente membrana intercalante tinte y se mezclan con las células de pollo corazón embrionarias que han sido teñidas con un colorante fluorescente diferente. Figura 4 muestra que en lugar de permanecer mezclados, las células del hígado y el corazón tienden a "una especie de salida" de unos a los otros y adoptar una esfera dentro de una esfera de configuración en la que las células del corazón están envueltas por las células del hígado. Esta configuración puede ser explicado por diferencias en la adhesión intercelular entre células del hígado y del corazón. Este concepto está codificado en la hipótesis de adhesión diferencial que se ha utilizado para explicar el comportamiento de clasificación de células de tejido embrionario entre la capa de germen de anfibios y ^tres embriones de teleósteos ^4, para la organización de células de los islotes pancreáticos y ⁵ de clasificación de células entre dos poblaciones de células idénticas in todos los demás aspectos que para los niveles de expresión del mismo tipo de cadherina ⁽⁶ y Figura 4B). Este resultado es particularmente importante para demostrar cómo la ingeniería una simple diferencia de adherencia entre las poblaciones de células puede resultar en la generación de la estructura del órgano, por ejemplo, un islote del páncreas ^5.

Figura 1. Imágenes de las células se incubaron en la cultura colgantes caída durante 18 horas ya sea en ausencia (A) o presencia (B) de 25 micras de los inhibidores de MEK PD98059. Las imágenes fueron capturadas con una Nikon Eclipse TE 300 microscopio de epifluorescencia y Fotometría CoolSnap cámara ES digital.

Figura 2. Cuantificación de Meki inducida por la compactación de la rata las células de cáncer de próstata MLL. Colgando culturas gota de células MLL tratados y Meki tratados se incubaron durante 18 horas después de lo cual el tamaño total se determinó como se describió anteriormente. El análisis estadístico de tamaño de los agregados fue por la t de Student prueba. El asterisco representa una diferencia estadísticamente significativa en el tamaño de los agregados (P <0,0001) entre las células no tratadas y tratadas Meki y sugiere que el tratamiento con Meki en agregados significativamente más pequeños y compactos.

Figura 3. Un esferoide formado mediante la incubación de las células de embriones de pollo en el hígado colgando cultura gota durante 18 horas después en una estufa / baño de agitación durante 48 horas. Esta imagen fue tomada usando un microscopio estereoscópico Nikon SMZ800 y una cámara CCD Sony Negro.

Figura 4. Colgantes cultura caída revela la clasificación de espera entre el comportamiento de diferentes tipos de células. En el panel A, las células de embriones de pollo hígado se tiñeron con PKH-2 membrana colorante intercalante y mezclado en proporciones iguales con PKH-26 células de pollo teñidas corazón embrionario. En el panel B, dos N-cadherina-transfectadas clones de células L (LN4 y LN2a), que expresan N-cad en su superficie en una proporción de 2,4:1, se tiñeron también con los tintes fluorescentes membrana intercalando PKH-2 y PKH 26 , (Sigma-Aldrich), mezclado en proporciones iguales y se cultivan como gotas colgando ^7. Después de 18 horas en cultivo, las hojas de la célula fueron trasladados a frascos de agitación y se incubó durante otras 48 horas. Los agregados fueron fijadas en paraformaldehído al 2% en tampón fosfato salino y se ve con un BioRad MRC600 sistema de escaneo láser confocal microscopio conectado a una Nikon Optiphot-2 microscopio. Secciones ópticas de los canales verde y rojo fueron recogidos y una estación de trabajo de Silicon Graphix Carmesí VGX equipado con Vital Images Voxel Ultra View software de imagen se utiliza para asignar colores falsos para ambos canales y para fusionar las imágenes, revelando las configuraciones anatómicas generado. (A) sección óptica confocal a través de un envolvimiento total que demuestra de las células del corazón (aquí, en un pseudo-color amarillo) por las células hepáticas en pseudocolor azul (de ^8). (B) Sección óptica confocal a través de un envolvimiento total de demostración de alta de N-cadherina células que expresan (verde) por los que expresan niveles más bajos de N-cadherina (rojo) (de ^6).

Discussion

Los estudios han demostrado que el cultivo de células en un contexto de tres dimensiones (3D) produce la morfología celular y la señalización distinta en comparación con un rígido de dos dimensiones del sistema de cultivo (2D) ^9. Por ejemplo, poblada de fibroblastos-geles de colágeno demostrar que la morfología de fibroblastos en 3D es muy distinta de la observada en 2D ^10,11. Del mismo modo, la cultura 3D puede inducir la diferenciación de tejidos específicos de las células epiteliales mamarias. Los sistemas de 3D ​​cultura se han utilizado para distinguir entre células normales y malignas y se ha demostrado que el apoyo de la reversión de las células transformadas con el fenotipo normal, dado el estímulo adecuado ^12,13. Arquitectura del tejido correcto también ha demostrado ser vital para el largo plazo homeostasis, la supresión de la apoptosis, y el mantenimiento del fenotipo diferenciado de CID-9 células epiteliales mamarias ^14. Resistencia a los medicamentos multicelulares en el ratón EMT-6 células de carcinoma de mama también se ha demostrado que se manifiesta in vitro sólo si las células fueron cultivadas en configuraciones de 3-D y no en cultivos en monocapa convencional ^15. Estos y otros datos han llevado a la propuesta de que "la unidad de la función en los organismos superiores no es ni el genoma de la célula, sino el tejido en sí" ^16. Muchos otros métodos de generación esferoides 3D existentes, incluyendo el uso de incubadoras de microgravedad simulada ^17, y micro-moldeado no adhesivo hidrogeles ^18,19. A diferencia de estos métodos sin embargo, el método aquí descrito no requiere de equipos especializados o de los reactivos y por tanto es altamente costo-efectiva. La simplicidad del método minimiza riesgos potenciales. En consecuencia, la curva de aprendizaje es relativamente poco profundo y el método puede ser dominado con facilidad en un período relativamente corto de tiempo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540