घाव मस्तिष्क चोट अध्ययन के लिए neuronal कोशिकाओं की आवेगी दबाव

Summary

एक उपन्यास आवेगी सेल दबाव प्रयोग विस्फोट प्रेरित घाव मस्तिष्क की चोट के आणविक / सेलुलर तंत्र की जांच के लिए एक Kolsky बार डिवाइस का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है.

Abstract

एक उपन्यास आवेगी सेल दबाव प्रयोग विस्फोट प्रेरित घाव मस्तिष्क चोट (TBI) की जांच के लिए एक Kolsky बार डिवाइस का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है. हम कैसे TBI प्रासंगिक विस्फोट आवेगी दबाव इन विट्रो में neuronal कोशिकाओं के लिए लागू किया जाता है इस वीडियो लेख में प्रदर्शित करता है. यह अच्छी तरह से नियंत्रित दबाव एक विशेष Kolsky बार डिवाइस के द्वारा बनाई गई नाड़ी का उपयोग, सेल दबाव दर्ज कक्ष के भीतर पूरा दबाव इतिहास के साथ हासिल की है. तुरंत दबाव के बाद दबाव neuronal कोशिकाओं का निरीक्षण कर रहे हैं, या आगे neurite / axonal परिणाम, neuronal जीन अभिव्यक्ति, apoptosis, आदि पर लंबी अवधि के आवेगी दबाव के प्रभाव हम के बारे में 2 MPa कि आवेगी दबाव मनाया जांच अलग neurite हानि सापेक्ष लाती है incubated unpressurized कोशिकाओं को. हमारी तकनीक मस्तिष्क की कोशिकाओं के आवेगी दबाव के माध्यम से अच्छी तरह से नियंत्रित जनसंपर्क में TBI विस्फोट की आणविक / सेलुलर तंत्र की जांच के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करता है,परिमाण और अवधि essure.

Protocol

1. Neuronal सेल संस्कृति Neuronal कोशिकाओं, astrocytes, और उनके सह संस्कृति सहित मस्तिष्क की कोशिकाओं को एक सेल मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. व्यवहार्यता के प्रदर्शन के रूप में, सेल लाइन neuronal कोशिकाओं के आवेगी pressurization प्रस्तुत किया है. एसएच SY5Y मानव neuroblastoma कोशिकाओं (ATCC, CRL २,२६६) 18 मिमी व्यास गिलास coverslips पर संवर्धित कर रहे हैं. कोशिकाओं 3 के घनत्व पर वरीयता प्राप्त × 10 3 कोशिकाओं / 2 सेमी वृद्धि DMEM की बनी मीडिया का उपयोग कर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन – स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक. सेल सभ्य गिलास स्लाइड एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है Neuronal सेल एसएच SY5Y कोशिकाओं के भेदभाव को प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं और मीडिया के साथ 7 दिनों के लिए 10 सुक्ष्ममापी retinoic एसिड (आरए) के साथ पूरक मीडिया के साथ व्यवहार कर रहे हैं दो दिनों हर बदल दिया है. 7 दिन, कोशिकाओं के लिए दबाव बनने के लिए तैयार कर रहे हैं. 2. दबाव उपकरण: Kolsky बार Kolsky बार, डे1949 में 1 Kolsky द्वारा veloped गया है के लिए एक बहुत उच्च दर पर लोड हो रहा है एक सामग्री के यांत्रिक संपत्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया. उपकरण में सलाखों के बीच संपर्क में रखा एक नमूने के साथ दो बार के होते हैं. एक तनाव की लहर, पट्टी पर घटना बनाया, जहां नमूना लहर परिलक्षित और प्रेषित लहर में विभाजन propagates. नमूने में तनाव प्रेषित लहर के लिए आनुपातिक है. इस अध्ययन में, हम एक सेल दबाव Kolsky के दो सेट अप सलाखों के बीच रखा जा कक्ष का उपयोग. दो एल्यूमीनियम मिश्र धातु सलाखों (प्रत्येक लंबे 6-मीटर) गठबंधन पीतल बीयरिंगों द्वारा निलंबित कर दिया है, और इन विट्रो सेल दबाव चैम्बर में सलाखों के बीच sandwiched है. नदी के ऊपर एक 130 £ एक छोर पर clamped जन के साथ घटना बार बार है. घर्षण क्लैंप एक स्थिति है कि वांछित स्पंद अवधि दे देंगे पर रखा गया है. क्लैंप आकर्षक और कस द्रव्यमान और एक लोडिंग समर्थन के बीच एक कैंची जैक, घटना बार के अनुभाग क्लैंप जन पूर्व गवांछित स्तर तक ompressed. एक नोकदार बोल्ट है कि एक हाइड्रोलिक प्रणाली के साथ अचानक ब्रेक क्लैंप ताले जबरदस्ती पूर्व संग्रहीत संपीड़न तेजी से जारी है और इस प्रकार एक दबाव पल्स उत्पन्न. यह घटना बार के माध्यम से प्रसारित, परीक्षण के चैम्बर पिस्टन ड्राइव, और कक्ष के भीतर तरल पदार्थ कोशिकाओं लालसे pressurizes. बदले में चैम्बर दबाव एक दबाव प्रेषित बार अनुप्रवाह में प्रचार नाड़ी शुरू. सलाखों में दबाव दालों के साथ जुड़े उपभेदों मिश्रित उच्च प्रतिरोध तनाव गेज के साथ 45 वोल्ट के लिए उत्साहित मापा जाता है. गेज संकेत 1 मेगाहर्ट्ज आवृत्ति पर एक लोडिंग इतिहास के रूप में एक डिजिटल आस्टसीलस्कप के साथ दर्ज हैं. इन विट्रो सेल दबाव चैम्बर में एक पिस्टन सिलेंडर से बना है. सिलेंडर 2.6 सेमी भीतरी व्यास 3.8 सेमी बाहरी व्यास है, और एक छोटे से छेद गुहा के आधार पर उपयोग किया है. छेद एक और अधिक तरल पदार्थ वेंट सेल नमूना स्थापना के दौरान हवा के रूप में कार्य करता है. पिस्टन 7.5 सेमी लंबा हैऔर एक ही बार सामग्री से बनाया गया है. पिस्टन प्लम्बर टेप (Teflon) के दो से तीन परतों है कि कम घर्षण सील के रूप में सेवा के साथ लिपटे है. अंत टोपी 32 मिमी लंबे और दो छोटे स्टेनलेस स्टील स्क्रू है कि लोड करने के दौरान कांच coverslips (जो कोशिकाओं संवर्धित कर रहे हैं) को सुरक्षित है. 3. Neuronal कोशिकाओं की आवेगी दबाव सभी दबाव चैम्बर भागों आटोक्लेव निष्फल का उपयोग कर रहे हैं और पराबैंगनी प्रकाश के तहत रखा जाता है. चैम्बर के विधानसभा सेल संस्कृति हुड के अंदर किया जाता है. चैम्बर में वेंट पेंच शिथिल गुहा के आधार पर हवा वेंट में लगे हुए है. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) ताजा विकास मीडिया कक्ष में बुलबुले बनाने के बिना pipetted है. फिर, एक कांच सेल सुसंस्कृत स्लाइड उठाया है, और पिस्टन की टोपी पर रखा गया है (बाहर का सामना करना पड़ रहा कोशिकाओं). जगह में पकड़ के लिए स्लाइड पर नीचे छोटे धारण शिकंजा कड़ा कर रहे हैं. सेल सुसंस्कृत एक गिलास स्लाइड के साथ पिस्टन डाला जाता है मैं एक छोटे सेNto चैम्बर की गुहा, और विधानसभा वेंट उच्चतम बिंदु पर जा रहा है साथ में झुका हुआ है. वेंट पेंच निकाल दिया है और पिस्टन 1 बाहर हवाई बुलबुले, तो अतिरिक्त तरल पदार्थ को मजबूर गुहा में धकेल दिया है. या तो एक संदर्भ चिह्न या एक जिग एक गाइड के रूप में हर परीक्षण के लिए एक ही संस्कृति मीडिया मात्रा सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कक्ष में मीडिया के axial आयाम के बारे में 6 मिमी है. वेंट पेंच Sanitize और इसे बदलने के लिए चैम्बर पानी तंग. चैम्बर इस स्थिर लोड के तहत लीक नहीं है, अगर यह होता है, Teflon लपेटो जगह या प्रबलित जरूरत चाहिए. इस बिंदु पर, Kolsky बार प्रणाली रीसेट है. भारी जन वापस मूल स्थिति में ले जाया जाता है और एक नया ताला बोल्ट का इस्तेमाल एक (टूट) की जगह. नया ताला लगा बोल्ट के बारे में 200 साई जलगति विज्ञान के साथ व्यस्त हैं. कैंची जैक का उपयोग करने के लिए एक वांछित मूल्य की तुलना में थोड़ा अधिक दबाव घटना बार के पूर्व लोड अनुभाग सेक, और फिर इसे वापस करने के लिए पूर्ण घर्षण संलग्नलोभी. डाटा अधिग्रहण अब लैस है. इकट्ठे सेल दबाव चैम्बर प्रणाली में मुहिम शुरू की है. यह एक वी छोटे प्रयोगशाला कैंची जैक द्वारा समर्थित ब्लॉक में रखा गया है और दो बार के साथ गठबंधन किया. एक प्रकाश तेल परत और butting सतहों साथ रगड़ के बीच में कोई हवा अंतराल को खत्म करने के साथ प्रत्येक इंटरफ़ेस तेल. परीक्षण अब आगे बढ़ने के लिए तैयार है. क्लैंप लॉकिंग बोल्ट के लिए जल्दी से हाइड्रोलिक क्लैंप ड्राइवर पंप से तोड़ने के लिए मजबूर कर रहा है. क्लैंप अलग और डाटा अधिग्रहण प्रदर्शित करना चाहिए परिणाम जाएगा. सेल दबाव इतिहास संचरित बार गेज की माप से निर्धारित किया जाता है. यदि प्रेषित इस्तेमाल किया बार लंबे समय पर्याप्त है, यह केवल 1 अशांति से बात करने के लिए हो सकता है, जहां माप एक नकारात्मक दबाव दिखाने चाहिए. संचरित नाड़ी की अवधि घटना नाड़ी की तुलना में कम हो सकता है अगर एक बुलबुला फंस गया है हो सकता है. परिमाण नाड़ी की घटना तक पहुँच नहीं है, लेकिन यह एक पर्याप्त लंदन होना चाहिएछ पठार उतारने से पहले. अन्यथा, या तो सील कक्ष या विधानसभा और एक बार के बीच एक misalignment में एक बड़ी हवा बुलबुला हुआ हो सकता है. सेल दबाव चैम्बर तो हटा दिया है और सेल संस्कृति हुड अंदर disassembled. वेंट पेंच निकाल दिया है और पिस्टन चैम्बर के मुक्त खींच लिया है. कांच का सेल सुसंस्कृत स्लाइड पिस्टन के अंत से लिया जाता है. 4. दबाव सेल व्यवहार का आकलन दबाव के बाद, कोशिकाओं को तुरंत निरीक्षण किया जा सकता है या आगे बाद में परीक्षा के लिए incubated. उचित सड़न रोकनेवाला आपरेशन प्रक्रियाओं के साथ लंबी अवधि के बाद ऊष्मायन संभव है. दबाव कोशिकाओं सभी सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान तकनीक के द्वारा जांच की जा सकती है. Neuronal सेल दबाव के लिए विशेष रूप से, TBI परिस्थितियों में सेलुलर और आणविक शरीर क्रिया विज्ञान की जांच करने के लिए, assays प्रेरित दबाव neurite परिणाम में परिवर्तन, microtubule cytoskeletal परिवर्तन, neuronal जीन expre का आकलनssion, apoptosis, आदि, प्रदर्शन किया जा सकता है. के रूप में नियंत्रण सेल के नमूने, कोशिकाओं है कि एक ही संवर्धित कर रहे हैं, एक ही समय अवधि के लिए दबाव कक्ष के अंदर रखा है, लेकिन दबाव नहीं (तथाकथित, नियंत्रण कक्ष) किया जाता है. Neurite परिणाम में परिवर्तन का आकलन करने के लिए दबाव और चैम्बर नियंत्रण कक्ष दबाव और 1 और 24 घंटे के बाद ऊष्मायन के बाद तुरंत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप से जांच कर रहे हैं. Neuronal सेल छवियों का एक उदाहरण 'प्रतिनिधि परिणाम' खंड (2 चित्रा) में दिखाए जाते हैं. neurite लंबाई परिवर्तन actin immunofluorescent धुंधला हो जाना और छवि विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. कोशिकाओं 4% paraformaldehyde w / v समाधान, 0.05% v / v Tween-20 धोने बफर के साथ rinsed के साथ तय कर रहे हैं, और एक 0.1% v / v ट्राइटन X-100 समाधान के साथ permeabilized. एक 1% w / v गोजातीय सीरम albumin समाधान के साथ अवरुद्ध करने के बाद, कोशिकाओं (TRITC) tetramethylrhodamine आइसोथियोसाइनेट संयुग्मित phalloidin साथ incubated हैं. कक्षों की छवियों Immunofluorescent एक फ्लोरोसेंट का उपयोग कर लिया जाता हैमाइक्रोस्कोप और दबाव और नियंत्रण कक्ष के लिए neurites की लंबाई ImageJ सॉफ्टवेयर (एनआईएच) का उपयोग मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. neurites या axons dendrites के रूप में पहचाना जा सकता है. या axons dendrites में morphological परिवर्तन का आकलन करने के लिए, प्रयोगों ऊपर वर्णित प्रत्येक संरचना का पता लगाने के एंटीबॉडी का उपयोग द्वारा दोहराया जा सकता है, यानी, dendrites के लिए और microtubule-जुड़े प्रोटीन एंटीबॉडी (MAP2) axons के लिए neurofilament प्रतिरक्षी (NF). सूक्ष्मनलिकाएं एक न्यूरॉन्स की कुंजी cytoskeletal घटकों के हैं, और सूक्ष्मनलिकाएं को नुकसान neuronal चोट के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है 2 microtubule immunofluorescently visualized एंटीबॉडी β-ट्यूबिलिन का उपयोग किया जा सकता है. सेल के बाद दबाव के 0 और 24 घंटे के बाद तय कर रहे हैं, β-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ दाग और फ्लोरोसेंट खुर्दबीन से मनाया. Neuronal और apoptotic जीन अभिव्यक्ति पर आवेगी दबाव के प्रभाव का आकलन करने के लिए, कुल शाही सेना दबाव और नियंत्रण कक्ष से निकाला जाता है. जनरलई अभिव्यक्ति मात्रात्मक RT-पीसीआर या वास्तविक समय RT-पीसीआर, हमारे प्रकाशित प्रोटोकॉल के लिए इसी तरह के प्रदर्शन के द्वारा जांच की जा सकती है 3. 5. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1. दबाव प्रोफाइल का एक उदाहरण दबाव कक्ष के भीतर कोशिकाओं के लिए लागू होता है. सफलतापूर्वक Kolsky बार तंत्र के बारे में 0.7 एमएस के एक अवधि के साथ 2 MPa स्तर, एक पल्स प्रकार आवेगी दबाव उत्पन्न करता है. चित्रा 2 neuronal सेल आवेगी दबाव प्रतिक्रिया का एक उदाहरण है. 2 MPa शो अलग / neurite अक्षतंतु कक्ष नियंत्रण कक्ष के सापेक्ष टूटने पर आवेगी दबाव एसएच SY5Y कोशिकाओं को अवगत कराया. 6. समस्या और समाधान चैंबर सील एक प्रमुख को दूर किया जा बाधाओं में से एक है. यह के लिए हैund कि O-छल्ले के साथ व्यापक डिस्क gouging और बढ़ घर्षण के एक समस्या है. आदेश में घर्षण के प्रभाव को दूर करने के लिए, साथ ही gouging, Teflon प्लम्बर टेप के साथ एक पिस्टन टेप की सरल विधि को रोकने है. इस समस्याओं को हल करती है और वांछित दबाव स्तर और अवधि का उत्पादन. दबाव neuronal सेल व्यवहार, खासकर जब माध्यमिक TBI तंत्र या लंबी अवधि के प्रभाव का आकलन करने, एक लंबे समय के बाद ऊष्मायन के बाद जांच की जानी चाहिए. चैम्बर सेल युक्त संभावित शर्तों unsterile जबकि Kolsky बार, दबाव, और सेल संस्कृति हुड से वापस जाने के लिए संपर्क में है. चैम्बर भागों और स्लाइड / सेल सुसंस्कृत और सेल संस्कृति हुड के अंदर कक्ष के disassembly विधानसभा में उचित कार्रवाई की पूर्व नसबंदी के साथ लंबी अवधि के बाद ऊष्मायन कई हफ्तों के लिए संभव है. डेटा के reproducibility सेलुलर यांत्रिक उत्तेजना प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. हमारे डिवाइस, reproducibilitneuronal सेल प्रतिक्रिया में y निर्धारित किया जाता है कैसे आवेगी दबाव प्रोफाइल वांछित दोनों दबाव स्तर और अवधि में, बार बार प्राप्त किया जाता है. चूंकि हम प्राप्त प्रत्येक दबाव के लिए दबाव प्रोफाइल रिकॉर्ड, अवांछित दबाव प्रोफ़ाइल से सेल प्रतिक्रिया डेटा मैन्युअल रूप से बाद में अपवर्जित कर सकते हैं. चैम्बर विधानसभा हस्तांतरण, और Kolsky बार, दबाव, हस्तांतरण वापस, और disassembly कक्ष में माउंट सहित पूरे दबाव कदम, कम से कम 10 मिनट लग. अगले सेल सुसंस्कृत स्लाइड पिछले दबाव के बाद तुरंत दबाव कर सकते हैं. इस प्रकार, दबाव प्रयोगों के लिए पर्याप्त संख्या में कुशलता से पूरा किया जा सकता है. हमारे सेट अप 18 मिमी व्यास गिलास coverslips का उपयोग किया जाता है. एक दबाव प्रयोग पश्चिमी के लिए पर्याप्त प्रोटीन immunoblotting सब्सट्रेट आकार की वजह से (और भी आंशिक रूप से क्योंकि दबाव की कोशिकाओं के कुछ मर चुके हैं) प्रदान नहीं करता है. के बारे में तीन दोहराया दबाव प्रयोगों प्रोटीन immunobl के लिए आवश्यक राशि प्रदान करते हैंotting. फिर, reproducibility दबाव प्रोफाइल के साथ हर बार की जाँच की है.

Discussion

इन विट्रो प्रयोगात्मक तकनीक में कई TBI परिस्थितियों में मस्तिष्क कोशिका क्षति का अध्ययन करने के लिए प्रयास किया गया है. ये न्यूरॉन / astrocyte खींच, प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव, वजन ड्रॉप, लेखनी पंगु बनाना, लेजर transection, lithotripsy, आदि ^4,5 यह मान लिया गया है कि लघु अवधि overpressure हावी TBI के लिए शारीरिक कारक है खासकर ^6,7. TBI विस्फोट की शॉकवेव मिसे के एक आदेश की एक नाड़ी की अवधि है ^4. इस धारणा को और प्रेक्षण के आधार पर, क्षणिक दबाव के बैरोमीटर सक्षम कक्ष विकसित किया गया है और TBI शर्तों के तहत मस्तिष्क कोशिका व्यवहार का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया. उदाहरण के लिए, तरल पदार्थ टक्कर दाब – अभिघात कक्ष में 20-30 एमएस लंबी अवधि और 0.5 MPa की एक चोटी पर दबाव के साथ दबाव नाड़ी TBI के तहत मानव glial सेल के व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ^6. हाल ही में, VandeVord एट अल. ⁷ धातु का इस्तेमाल किया गेंद हड़ताली बैरोमीटर astrocyte सेल की जांच कक्षTBI के तहत व्यवहार लेकिन धातु गेंद कई दबाव दालों का उत्पादन हड़ताली. इस अध्ययन में, हम एक उपन्यास सेल दबाव युक्ति है कि एकल नाड़ी प्रकार आवेगी दबाव उत्पन्न विकसित किया है. डिवाइस Kolsky बार सेट अप है, जो हमारे ⁸ और अन्य अध्ययन में एक सामग्री परीक्षण उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है के आधार पर विकसित किया गया था ^1,9 बहुत उच्च लोड दर पर Kolsky बार सामग्री के परीक्षण की क्षमता करने के लिए सक्षम होना करने के लिए संशोधित किया गया है. दबाव चैम्बर (1 चित्रा) के भीतर संवर्धित कोशिकाओं के लिए एकल नाड़ी प्रकार overpressure लागू होते हैं. हम सफलतापूर्वक परिमाण और आवेगी overpressure की अवधि को नियंत्रित कर सकता है. एक प्रतिनिधि सेल प्रतिक्रिया के रूप में, हम प्रदर्शन किया है कि 2 MPa दबाव एसएच SY5Y neuronal कोशिकाओं में महत्वपूर्ण neurite और axonal हानि प्रदर्शित unpressurized कक्ष नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में.

अंत में, हम एक उपन्यास आवेगी सेल दबाव तंत्र का उपयोग करते हुए एक विशेष रूप से डिजाइन Kolsky विकसितबार और डिवाइस TBI स्थितियों में neuronal सेल प्रतिक्रिया की जांच में अपनी क्षमता का उपयोग का प्रदर्शन किया. हम यह भी ध्यान दें कि इस तकनीक में बहुमुखी है कि कोशिकाओं के किसी भी प्रकार के विभिन्न स्तर और अवधि में आवेगी दबाव को उजागर किया जा सकता है. इसलिए, इस डिवाइस आवेगी दबाव प्रेरित सेलुलर mechanotransduction व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है न केवल घायल हो कोशिकाओं के लिए, लेकिन यह भी उनके कार्य और भाग्य निर्धारण में कोशिकाओं उत्तेजक के लिए सकारात्मक है.

Materials

• SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells
• 18 mm diameter glass coverslips
• Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin
• Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis
• Kolsky bar impulsive pressurization device
• Piston-cylinder cell pressurization chamber
• Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston
• Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar
• General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.)