التسرع الضغط من الخلايا العصبية في الدماغ الرضية لدراسة الإصابات

Summary

وقد وضعت رواية الضغط الخلية التسرع التجربة باستخدام جهاز شريط Kolsky للتحقيق في الآليات الجزيئية / الخلوية من الانفجار الناجم إصابات في الدماغ.

Abstract

وقد وضعت رواية الضغط الخلية التسرع التجربة باستخدام جهاز شريط Kolsky للتحقيق الانفجار الناجم عن إصابات في الدماغ (المصرف التجاري العراقي). نبين في هذه المقالة الفيديو كيفية تطبيق الانفجار TBI ذات الصلة التسرع الضغط على الخلايا العصبية في المختبر. ويتحقق ذلك عن طريق استخدام جيدا للرقابة نبض الضغط إنشاؤها بواسطة جهاز شريط Kolsky المتخصصة، مع التاريخ الكامل الضغط داخل الخلية غرفة الضغط المسجلة. يتم تفتيشها الخلايا العصبية الضغط مباشرة بعد الضغط، أو المحتضنة إلى مواصلة دراسة الآثار طويلة الأمد للالضغط على التسرع محوار / محور عصبي ثمرة، العصبية التعبير الجيني، موت الخلايا المبرمج، وما إلى ذلك لاحظنا أن الضغط التسرع في حوالي 2 ميجا باسكال يدفع متميزة النسبية فقدان محوار إلى خلايا unpressurized. أسلوبنا يوفر طريقة جديدة للتحقيق في الآليات الجزيئية / الخلوية من الانفجار TBI، عبر الضغط من التسرع في خلايا الدماغ التي تسيطر عليها بشكل جيد في العلاقات العامةessure حجم ومدة.

Protocol

1. خلية العصبية الثقافة

1. ويمكن استخدام خلايا المخ بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، وتعاونها الثقافة كنموذج الخلية. كدليل جدوى، ويرد التسرع الضغط من الخلايا العصبية خلايا الخط.
2. يتم استزراع SH-SY5Y الخلايا العصبية البشرية (ATCC، CRL-2266) في 18 مم coverslips الزجاج القطر. والمصنف الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3 × 10 ³ خلية / سم ² استخدام وسائل الإعلام نمو تتألف من DMEM تستكمل مع مصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ البنسلين الستربتوميسين. يتم الاحتفاظ الشرائح الزجاجية مثقف الخلايا في الحاضنة 5٪ ₂ CO مرطب في C. ° 37
3. تغيرت للحصول على تمايز الخلايا العصبية من الخلايا SH-SY5Y، تعامل مع وسائل الإعلام الخلايا تكميل مع 10 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA) لمدة 7 أيام مع وسائل الاعلام كل يومين. في يوم 7، الخلايا على استعداد لتكون مضغوطة.

2. معدات الضغط: Kolsky بار

1. شريط Kolsky، ديveloped من Kolsky ¹ في عام 1949، وقد استخدمت لقياس الخاصية الميكانيكية للمادة بمعدل التحميل عالية جدا. الجهاز يتكون من اثنين من الحانات مع عينة وضعت في الاتصال بين القضبان. موجة الإجهاد، والتي تم إنشاؤها على شريط الحادث، لتنتشر العينة حيث تنقسم إلى موجة موجة ينعكس والمنقولة. الضغط في العينة يتناسب مع موجة المرسلة. في هذه الدراسة، ونحن الاستفادة من غرفة الضغط الخلية لتوضع بين اثنين من قضبان Kolsky انشاء.
2. وعلقت سبائك الألومنيوم بارين (كل 6 طويل م) من النحاس الأصفر محامل الانحياز، وتقع على الخلية في المختبر غرفة الضغط بين القضبان. شريط المنبع هو شريط الحادث مع كتلة رطل 130 فرضت على نهاية واحدة. يتم وضع المشبك الاحتكاك عند موضع من شأنها أن تعطي مدة النبض المطلوب. من خلال الانخراط في المشبك وتشديد جاك المقص بين الكتلة ودعم التحميل، وقسم المشبك الشامل من شريط الحادث قبل جompressed إلى المستوى المطلوب. إجبار الترباس ان اقفال حقق المشبك إلى انقطاع مفاجئ مع النظام الهيدروليكي إصدارات ما قبل ضغط المخزنة بسرعة وبالتالي يولد نبضة الضغط. هذا النشر من خلال شريط الحادث، يدفع المكبس غرفة الاختبار، وتمارس ضغوطا على السوائل والخلايا داخل غرفة باندفاع. والضغط غرفة بدوره يبدأ النبض الضغط نشر في المصب شريط المنقولة. يتم قياس الضغوط المرتبطة نبضات الضغط في الحانات مع ارتفاع مجمع مقاييس سلالة مقاومة متحمس إلى 45 فولت. وتسجل الإشارات قياس الذبذبات الرقمية مع تردد في ميغاهرتز (1)، تاريخ التحميل.
3. تتكون الخلية في المختبر غرفة الضغط من اسطوانة المكبس. الاسطوانة لديه 2،6 سم القطر الداخلي والخارجي 3.8 سم القطر، ولها ثقب صغير استغلالها في قاعدة تجويف. الحفرة بمثابة تنفيس الهواء والسوائل الزائدة أثناء التثبيت عينة الخلية. المكبس هو 7.5 سم طويلةويصنع من المواد نفسها بار. يتم التفاف المكبس مع كلمتين أو ثلاث طبقات من الشريط (تفلون) سباك والتي تكون بمثابة ختم الاحتكاك منخفضة. الحد الأقصى هو 32 ملم نهاية فترة طويلة واثنين من البراغي الصغيرة الفولاذ المقاوم للصدأ التي تثبت coverslips الزجاج (الذي يتم استزراع الخلايا) خلال تحميل.

3. التسرع الضغط من الخلايا العصبية

1. يتم تعقيم جميع أنحاء غرفة الضغط باستخدام الأوتوكلاف ويتم الاحتفاظ تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يتم تنفيذ الجمعية للغرفة داخل الخلية هود الثقافة. وتشارك فضفاضة المسمار تنفيس في غرفة في تنفيس الهواء في قاعدة تجويف. قبل تحسنت (37 ° C) وسائل الإعلام pipetted نمو جديدة في غرفة دون فقاعات. ثم، يتم اختيار شريحة زجاجية الخلايا المستزرعة أعلى، ويتم وضعها على سقف للمكبس (الخلايا التي تواجه خارج). يتم شد البراغي الصغيرة الضغط باستمرار على الشريحة ليثبت في مكانه. يتم إدراج المكبس مع شريحة زجاجية الخلايا المستزرعة قليلا طيميل n لتجويف للغرفة، والجمعية مع تنفيس يجري في أعلى نقطة. تتم إزالة المسمار تنفيس ويتم الضغط على المكبس إلى تجويف إجبار أول مرة فقاعات الهواء، ثم السوائل الزائدة. إما يتم استخدام العلامة المرجعية أو رقصة لكدليل لضمان نفس حجم وسائل الإعلام الثقافة لكل اختبار. البعد المحوري من وسائل الإعلام في الغرفة هو حوالي 6 مم. تطهير المسمار تنفيس واستبدالها لجعل المياه غرفة ضيقة. وينبغي للغرفة لا تسرب تحت هذا حمولة ساكنة، إذا كان كذلك، التفاف تفلون يحتاج إلى استبداله أو تعزيزها.
2. في هذه المرحلة، ونظام شريط Kolsky تتم إعادة تعيين. يتم نقل كتلة ثقيلة مرة أخرى إلى وضعه الأصلي والترباس قفل الجديدة محل المستخدمة (بكسر) واحد. إشراك الترباس قفل جديد مع الهيدروليكية لنحو 200 رطل لكل بوصة مربعة. استخدام مقص جاك لضغط المقطع ما قبل التحميل من شريط الحادث حتى ضغط أعلى قليلا من القيمة المطلوبة، و من ثم تشغيله لإشراك الاحتكاك الكامل للالمسمار جاك. وهو مسلح الآن الحصول على البيانات.
3. هي التي شنت على خلية الضغط تجميعها غرفة في النظام. يتم وضعها في كتلة صغيرة V بدعم من مقص جاك المختبر وتتماشى مع بارين. كل واجهة الشحوم مع طبقة الشحوم الخفيفة وفرك السطوح النطح معا للقضاء على أي ثغرات في الهواء بينهما.
4. الاختبار هو الآن على استعداد للمضي قدما. يتم فرض قفل الترباس المشبك لكسر بسرعة عن طريق ضخ السائق المشبك الهيدروليكي. فإن المشبك فصل وينبغي الحصول على البيانات عرض النتائج. يتم تحديد تاريخ الضغط خلية من قياسات مقياس شريط المنقولة. إذا كان شريط المنقولة المستخدمة هي فترة كافية، ينبغي أن يكون هذا إلا من الاضطراب لدرجة القياسات تظهر الضغط السلبي. قد مدة نبض المنقولة تكون أقصر من نبض الحادث إذا المحاصرين فقاعة. قد لا تصل إلى حجم أن للنبض الحادث، لكنه ينبغي أن يكون لها خط الطول بما فيه الكفايةز الهضبة قبل التفريغ. خلاف ذلك، قد حدثت إما فقاعة الهواء الكبيرة في غرفة مغلقة أو اختلال بين الجمعية وبار.
5. ثم تتم إزالة غرفة الضغط الخلايا وتفكيكها داخل الخلية هود الثقافة. تتم إزالة المسمار تنفيس ويتم سحبها المكبس الحرة من الغرفة. يتم أخذ شريحة زجاجية الخلايا المستزرعة من نهاية المكبس.

4. تقييم الضغط سلوك الخلية

1. بعد الضغط، قد تفقد الخلايا المحتضنة فورا أو في وقت لاحق مزيد من الفحص. مع عمليات التشغيل السليم العقيم، على المدى الطويل بعد الحضانة هو ممكن.
2. يمكن فحص الخلايا المضغوط عليها جميع تقنيات البيولوجيا الجزيئية والخلوية. الضغط خصيصا لخلية العصبية، للتحقيق في علم وظائف الأعضاء الخلوية والجزيئية في ظروف TBI، المقايسات تقييم الضغط الناجم عن التغيرات في ثمرة محوار، وتغير هيكل الخلية أنيبيب، العصبية expre الجيناتلا يمكن أن يؤديها ssion، موت الخلايا المبرمج، وما إلى ذلك. كعينات الخلية السيطرة، الخلايا التي يتم زرعها في نفسه، أبقى داخل غرفة الضغط لنفس الفترة الزمنية، ولكن لا تستخدم الضغط (تسمى بذلك، غرفة التحكم).
3. لتقييم التغيرات في ثمرة محوار، ويتم فحص الخلايا السيطرة والضغط من قبل غرفة المجهر الضوئي مباشرة بعد الضغط و 1 و 24 ساعة من الحضانة بعد. وتظهر الصور مثال على خلية العصبية في قسم "النتائج الممثل" (الشكل 2). يمكن تغيير طول كميا محوار من تلطيخ الأكتين مناعي وتحليل الصور. يتم إصلاح الخلايا بمحلول بارافورمالدهيد 4٪ ث / ت، تشطف مع 0.05٪ V / V-20 توين العازلة يغسل، وpermeabilized مع 0.1٪ V / V-100 X حل تريتون. بعد حجب مع 1٪ وزن / حجم مصل بقري الزلال حل، يتم تحضين الخلايا مع ثيوسيانات tetramethylrhodamine (TRITC)-مترافق phalloidin. تؤخذ الصور مناعي للخلايا باستخدام الفلورسنتوكميا المجهر وأطوال neurites التي لخلايا الضغط والتحكم باستخدام برنامج يماغيج (NIH).
4. ويمكن تحديد محاور عصبية neurites التي والتشعبات أو. ويمكن تكرار لتقييم التغيرات المورفولوجية في محاور عصبية أو التشعبات، والتجارب المذكورة أعلاه باستخدام الأجسام المضادة كشف كل بنية، أي خيط عصبي (NF) الأجسام المضادة للمحاور عصبية وأنيبيب المرتبطة بروتين الأجسام المضادة (MAP2) لالتشعبات.
5. ميكروتثبول هي واحدة من المكونات الرئيسية للهيكل الخلية من الخلايا العصبية، واستخدمت الأضرار التي لحقت ميكروتثبول كعلامة للإصابة الخلايا العصبية .. ² أنيبيب يمكن تصور immunofluorescently باستخدام الأجسام المضادة β-تويولين. يتم إصلاح الخلايا بعد 0 و 24 ساعة من الضغط بعد، β-ملطخة تويولين الأجسام المضادة، والتي لاحظها المجهر الفلورسنت.
6. لتقييم تأثير الضغط على التسرع والعصبية التعبير الجيني أفكارك، يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا الضغط والسيطرة عليها. الجنراليمكن فحص البريد التعبير الكمي عن طريق إجراء RT-PCR أو في الوقت الحقيقي PCR-RT، على غرار البروتوكولات نشرت لدينا .. ³

5. ممثل النتائج:

الشكل 1. تطبيق مثال على الملف ضغط على خلايا داخل غرفة الضغط. جهاز شريط Kolsky يولد بنجاح المستوى 2 ميجا باسكال، واحد نبض الضغط نوع التسرع مع مدة حوالي 0.7 مللي.

الشكل 2. مثال على استجابة الخلايا العصبية لالتسرع الضغط. SH-SY5Y الخلايا المعرضة لالضغط التسرع في 2 ميجا باسكال انهيار عرض محوار / محور عصبي متميزة بالنسبة لخلايا التحكم الغرفة.

6. الصعوبات والحلول

1. غرفة الختم هي واحدة من العقبات الرئيسية التي يتعين التغلب عليها. فمن FOاوند أن الأقراص واسعة مع طوقية لديك مشكلة من تلاعب وزيادة الاحتكاك. من أجل إزالة آثار الاحتكاك، فضلا عن منع تلاعب، طريقة بسيطة ليوصل المكبس مع تفلون الشريط سباك هو المستخدمة. هذا لا يحل المشاكل وتنتج المطلوب مستوى ضغط ومدتها.
2. الضغط سلوك الخلية العصبية، وخصوصا عندما تقييم آلية TBI الثانوية أو تأثيرات على المدى الطويل، ينبغي فحص بعد مرور فترة زمنية طويلة بعد الحضانة. يتعرض للغرفة التي تحتوي على خلايا غير معقمة لظروف يحتمل في الوقت الذي يتجه إلى شريط Kolsky، الضغط، وطريق العودة إلى الخلية هود الثقافة. مع التعقيم المسبق للأجزاء الدائرة والتشغيل السليم في الجمعية / التفكيك من الشريحة الخلايا المستزرعة وغرفة داخل الخلية هود والثقافة، وعلى المدى الطويل بعد الحضانة من الممكن تصل إلى عدة أسابيع.
3. واستنساخ البيانات هو معلمة هامة في التجارب الخلوية التحفيز الميكانيكي. لدينا جهاز، وreproducibilitيتم تحديد Y استجابة الخلايا العصبية كيف المطلوب التسرع الشخصي الضغط، في مستوى ضغط كل من ومدتها، ويتم الحصول مرارا وتكرارا. منذ نسجل البيانات الشخصية التي تم الحصول عليها عن كل ضغط الضغط، يمكن البيانات من ملف التعريف استجابة الخلية الضغط غير المرغوب فيها استبعاد يدويا بعد ذلك.
4. الخطوات الضغط بأكمله، بما في ذلك نقل غرفة والتجمع وجبل في شريط Kolsky، الضغط، ونقل مرة أخرى، وغرفة التفكيك، يستغرق أقل من 10 دقيقة. يمكن الشريحة الخلية التالية مثقف ضغط مباشرة بعد الضغط السابق. وبالتالي، يمكن أن تكتمل عدد كاف من التجارب الضغط بكفاءة. لدينا مجموعة المتابعة يستخدم 18 مم coverslips الزجاج القطر. تجربة واحدة لا يوفر الضغط ما يكفي من البروتينات لغربي immunoblotting بسبب حجم الركيزة (ويرجع ذلك جزئيا أيضا بعض الخلايا قد لقوا حتفهم الضغط). عن ثلاث تجارب الضغط المتكرر توفير كمية البروتين المطلوبة لimmunoblotting. مرة أخرى، يتم فحص كل مرة استنساخ مع التشكيل الجانبي الضغط.

Discussion

وقد حاول العديد من أساليب فنية تجريبية في المختبر لدراسة الدماغ تلف الخلايا في ظروف TBI. وتشمل هذه الخلايا العصبية / نجمية تمتد، والتي يسببها تدفق إجهاد القص، وانخفاض الوزن، وتهتك قلم، ليزر transection، تفتيت الحصاة، وما إلى ذلك ^4،5 وقد افترض أن مدة قصيرة الضغط الزائد هو العامل المهيمن المادية للTBI. ^6،7 خاصة وحدثت الهزة الارضية من الانفجار TBI لديه مدة النبضة من أمر ميلي ثانية. ⁴ تستند علي هذا الافتراض والملاحظة، وقد تم تطوير غرفة مقياسا قادرة على الضغط عابرة وتستخدم لتقييم السلوك الدماغ خلية في ظل ظروف TBI. على سبيل المثال، في قاعة السائل الضغطي قرع نبضة الضغط مع مرض التصلب العصبي المتعدد مدة طويلة و20-30 ضغط الذروة تصل إلى 0.5 ميجا باسكال كان يستخدم لفحص سلوك الإنسان الخلية الدبقية تحت TBI .. ⁶ في الآونة الأخيرة، وآخرون VandeVord .. ⁷ المعدن الذي يستخدم غرفة الكرة مقياسا لدراسة ضرب الخلية نجميةضرب تنتج السلوك تحت TBI لكن الكرة المعدنية البقول ضغط متعددة. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير جهاز الضغط خلية الرواية التي تولد الضغط واحد نبض نوع التسرع. وقد تم تطوير الجهاز يعتمد على شريط Kolsky مجموعة المتابعة، التي كانت تستخدم كمادة جهاز الفحص في الدراسات ⁸ و أخرى لدينا. تم تعديل ^1،9 اختبار المواد شريط Kolsky في القدرة على معدل التحميل عالية جدا لتكون قادرة على تطبيق واحد نبض من نوع الضغط الزائد إلى الخلايا المستزرعة داخل غرفة الضغط (الشكل 1). يمكننا السيطرة بنجاح حجم ومدة الضغط الزائد التسرع. كرد فعل الخلية ممثل، أثبتنا أنه في الخلايا ميغاباسكال 2 SH-SY5Y الضغط العصبية محوار عرض كبيرة وفقدان محور عصبي بالمقارنة مع الخلايا السيطرة unpressurized الغرفة.

وفي الختام، وضعنا رواية الضغط الخلية التسرع باستخدام جهاز صمم خصيصا Kolskyأظهرت جهاز شريط واستخدامه في التحقيق في احتمال استجابة الخلية العصبية في ظروف TBI. ونلاحظ أيضا أن هذه التقنية متعددة جدا في هذا يمكن أن يتعرض أي نوع من الخلايا لضغوط التسرع على مستوى مختلف ومدتها. ولذلك، يمكن استخدام الجهاز للتحقيق في التسرع الضغط الناجم عن السلوك mechanotransduction الخلوية، ليس فقط لاصابة الخلايا ولكن أيضا لحفز الخلايا بشكل إيجابي في وظيفتها وتحديد مصير.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells
18 mm diameter glass coverslips
Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin
Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis
Kolsky bar impulsive pressurization device
Piston-cylinder cell pressurization chamber
Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston
Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar
General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.)