Summary
Eine neuartige impulsive Zelle Druckbeaufschlagung Experiment wurde unter Verwendung eines Kolsky bar-Gerät, um die molekularen / zellulären Mechanismen der Hochofen-induzierte traumatische Hirnverletzung zu untersuchen.
Abstract
Eine neuartige impulsive Zelle Druckbeaufschlagung Experiment wurde unter Verwendung eines Kolsky bar Gerät blast-induzierten Schädel-Hirn-Trauma (SHT) zu untersuchen. Wir zeigen in diesem Video Artikel, wie Blast TBI-relevanten impulsive Druckbeaufschlagung zu den neuronalen Zellen in vitro angewendet wird. Dies wird durch Verwendung gut kontrollierten Druckimpuls von einem spezialisierten Kolsky bar Vorrichtung geschaffen, mit komplettem Druckverlauf innerhalb der Zelle gespeichert Druckkammer erreicht. Druck stehenden neuronalen Zellen unmittelbar nach Druckbeaufschlagung inspiziert oder weiter inkubiert, um die langfristigen Auswirkungen von impulsartigen Druckbeaufschlagung auf Neuriten / axonalen Wachstums, neuronale Genexpression, Apoptose usw. Wir beobachteten, dass treibend Druckbeaufschlagung mit etwa 2 MPa untersuchen induziert Neurit deutlichen Verlust relativen zur drucklosen Zellen. Unsere Technik stellt ein neues Verfahren, um die molekularen / zellulären Mechanismen der Explosion TBI untersuchen, über treibend Druckbeaufschlagung Hirnzellen bei gut kontrollierten prEssure Größe und Dauer.
Protocol
Ein. Neuronale Zellkulturen
- Gehirnzellen einschließlich neuronaler Zellen, Astrozyten und ihre Co-Kultur kann als eine Zelle Modell verwendet werden. Als einer Machbarkeitsstudie Demonstration wird impulsive Druckbeaufschlagung Zelllinie neuronalen Zellen präsentiert.
- SH-SY5Y-Neuroblastom-menschlichen Zellen (ATCC, CRL-2266) auf 18 mm Durchmesser Deckgläschen kultiviert. Die Zellen werden in einer Dichte von 3 × 10 3 Zellen / cm 2 unter Verwendung der Wachstumsmedien aus DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin. Zellkultur kultiviert Glasobjektträger in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C gehalten wird
- Die neuronalen Zelldifferenzierung von SH-SY5Y-Zellen zu erhalten, die Zellen mit Medium ferner mit 10 pM Retinsäure (RA) für 7 Tage mit Medien ergänzt behandelt alle zwei Tage gewechselt. Am Tag 7 sind Zellen bereit, unter Druck gesetzt werden.
2. Druckbeaufschlagung Ausstattung: Kolsky Bar
- Die Kolsky bar, deentwickelt durch Kolsky 1 1949, wurde verwendet, um die mechanische Eigenschaft aus einem Material mit einer sehr hohen Belastung zu messen. Die Vorrichtung besteht aus zwei Bügeln mit einer Probe in Kontakt zwischen den Stangen angeordnet. Spannungswellen-, auf der einfallenden bar angelegt, ausbreitet zu der Probe, wo die Welle spaltet sich in einem reflektierten und transmittierten Welle. Die Spannung in der Probe proportional zu der gesendeten Welle. In dieser Studie, verwenden wir eine Zelle Druckkammer zwischen den beiden Stangen des Kolsky Set-up abgegeben werden.
- Die beiden Aluminium-Legierung Stäbe (jeweils 6-m) werden von ausgerichteten Messinglagern suspendiert und eine in vitro-Zelle Druckkammer ist zwischen den Stäben eingeklemmt. Der Upstream-bar ist der Vorfall bar mit einem 130 £ Masse auf ein Ende eingespannt. Reibungsmaterial Klammer in einer Position, die die gewünschte Impulsdauer geben wird platziert. Durch Schließen der Klammer und Anziehen einer Schere Buchse zwischen der Masse und einer Belastungshalterung ist die Klammer-Masse-Abschnitt des einfallenden bar pre-compressed auf das gewünschte Niveau. Erzwingen einer gekerbten Schraube, die die Klemme verriegelt zu einem plötzlichen Bruch mit einem hydraulischen System löst die zuvor gespeicherte Kompression schnell und erzeugt somit einen Druckimpuls. Diese breitet sich durch den Vorfall bar, treibt die Prüfkammer Kolben und unter Druck die Flüssigkeit und Zellen in der Kammer impulsiv. Die Kammer Druckbeaufschlagung wiederum löst einen Druckimpuls Verbreitung in den übertragenen bar stromabwärts. Die Stämme mit der Druckimpulse in den Stäben verbunden sind mit Verbindung hoher Dehnungsmessstreifen angeregt bis 45 Volt gemessen. Die Spurweite Signale werden mit einem digitalen Oszilloskop bei 1 MHz Frequenz als Belastung aufgezeichnet.
- Die in vitro-Zelle Druckkammer besteht aus einem Kolben-Zylinder zusammensetzt. Der Zylinder weist 2,6 cm Innendurchmesser und 3,8 cm Außendurchmesser und weist eine kleine Öffnung an der Basis des Hohlraums abgegriffen. Das Loch dient als Luft und überschüssige Flüssigkeit Entlüftung während der Zellprobe Installation. Der Kolben ist 7,5 cm langund aus dem gleichen Material hergestellt bar. Der Kolben ist mit zwei bis drei Schichten der Klempner (Teflon)-Band, die als reibungsarme Dichtung dienen gewickelt. Die Endkappe ist 32 mm lang und hat zwei kleinen Schrauben aus rostfreiem Stahl, die die Deckgläser (auf denen Zellen kultiviert werden) während des Ladens zu sichern.
3. Impulsive Druckbeaufschlagung von neuronalen Zellen
- Alle Druckkammer Teile sterilisiert mit dem Autoklaven und unter UV-Licht gehalten. Die Anordnung der Kammer im Inneren der Haube Zellkultur durchgeführt. Die Entlüftungsschraube in der Kammer ist lose in die Lüftungsöffnung an der Basis des Hohlraums in Eingriff. Vorgewärmten (37 ° C) frisches Nährmedium in die Kammer ohne Luftblasen pipettiert. Dann wird ein Zell-kultivierten Glasobjektträger aufgenommen, und wird an der Kappe des Kolbens platziert (Zellen zugewandten Außenseite). Die kleinen Halteschrauben sind nach unten auf die Folie halten Sie sie fest angezogen sind. Der Kolben mit einem Zell-kultivierte Glasobjektträger eingefügt etwas into der Hohlraum der Kammer, und die Anordnung mit der Entlüftungsöffnung ist an der höchsten Stelle gekippt wird. Die Entlüftungsschraube wird entfernt und der Kolben in den Hohlraum ersten Herausdrücken Luftblasen, dann die überschüssige Flüssigkeit geschoben. Entweder eine Referenzmarke oder eine Spannvorrichtung ist als Leitfaden verwendet werden, um die gleiche Kultur Datenträger für jeden Test zu gewährleisten. Die axiale Abmessung der Medien in der Kammer beträgt ca. 6 mm. Desinfizieren Sie die Entlüftungsschraube und ersetzen Sie sie, um die Kammer wasserdicht zu machen. Die Kammer sollte nicht unter diese statische Belastung auslaufen, wenn es funktioniert, die Teflon-Wrap ersetzt oder verstärkt werden muss.
- An diesem Punkt ist das System zurückgesetzt Kolsky bar. Die schwere Masse wird wieder in die ursprüngliche Position bewegt und ein neues ersetzt den Verriegelungsbolzen verwendet (gebrochen) ein. Aktivieren Sie den neuen Riegel mit der Hydraulik auf etwa 200 psi. Verwenden Sie die Schere Buchse, um das pre-loading Abschnitt des Vorfalls bar komprimiert bis zu einem Druck etwas höher als der gewünschte Wert, und Sie ihn dann, um die volle Reibung der EingriffJacks Schraube. Die Datenerfassung ist scharf.
- Die zusammengebauten Zelle Druckkammer in das System montiert ist. Es liegt in einer V-Block durch kleine Schere lab Wagenheber platziert und ausgerichtet mit den beiden Stäben. Fett jede Schnittstelle mit einer leichten Fettschicht und reiben Sie die Stoßflächen zusammen, um eventuell vorhandene Lücken zwischen beseitigen.
- Der Test ist nun bereit, um fortzufahren. Die Klammer Riegel ist gezwungen, durch schnelles Pumpen der hydraulische Klemme Fahrer brechen. Die Klemme wird trennen und die Datenerfassung sollten die Ergebnisse anzuzeigen. Die Zelle Druckbeaufschlagung Geschichte wird aus den Messungen des übertragenen bar Überdruck bestimmt. Wenn das übertragene bar eingesetzt ist lang genug, sollte dies nur von der ersten Störung an der Stelle sein, wo die Messungen einen Unterdruck zu zeigen. Die Dauer des Sendeimpulses kann kürzer als der einfallenden Pulses, wenn eine Luftblase eingeschlossen wird. Die Größe kann nicht erreichen, dass der einfallenden Pulses, aber es sollte eine ausreichend lon habeng Plateau vor Entladung. Andernfalls könnte entweder eine große Luftblase in der abgedichteten Kammer oder einer Fehlausrichtung zwischen der Anordnung und einer Bar aufgetreten sind.
- Die Zelle Druckkammer wird dann entfernt und demontiert Inneren der Zellkultur Haube. Die Entlüftungsschraube wird entfernt und der Kolben frei gezogen der Kammer. Das Zell-kultivierten Glasobjektträger von dem Ende des Kolbens aufgenommen.
4. Beurteilung Pressurized Zellverhalten
- Nach Druckbeaufschlagung können die Zellen unmittelbar eingesehen werden oder weiter zur späteren Untersuchung inkubiert. Mit der richtigen aseptischen Betrieb Prozessen ist längerfristigen post-Inkubation möglich.
- Pressurized Zellen können von allen Molekular-und Zellbiologie Techniken untersucht werden. Speziell für Nervenzellen Druckbeaufschlagung, um die zellulären und molekularen Physiologie TBI Bedingungen zu untersuchen, Assays Beurteilung Druck-induzierten Veränderungen in Neuritenwachstum, Mikrotubuli-Zytoskelett Veränderung neuronaler Gens Expression, Apoptose, etc., durchgeführt werden kann. Als Kontrolle Zellproben, Zellen, die denselben gezüchtet werden, im Inneren der Druckkammer für die gleiche Zeitperiode gehalten, jedoch nicht unter Druck verwendet werden (sogenannte, Kammer-Kontrolle).
- Für die Beurteilung der Veränderungen in Neuritenwachstum, werden unter Druck und der Kammer Kontrollzellen durch optische Mikroskop unmittelbar nach Druckbeaufschlagung und 1 und 24 h post-Inkubation untersucht. Ein Beispiel Nervenzellen Bilder werden in die "repräsentativen Ergebnisse 'Abschnitt (Abbildung 2). Die Neuritenlänge Veränderung kann durch Aktin Immunfluoreszenzfärbung und Bildanalyse quantifiziert werden. Die Zellen werden mit 4% w / v Paraformaldehydlösung mit einer 0,05% v / v Tween-20-Waschpuffer gespült fixiert, permeabilisiert und mit einer 0,1% v / v Triton X-100-Lösung. Nach dem Blockieren mit einer 1% w / v Rinderserumalbumin-Lösung werden die Zellen mit Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)-konjugierter Phalloidin inkubiert. Immunofluoreszenz-Bilder der Zellen getroffen werden mit einem fluoreszierendenMikroskop und die Längen von Neuriten für unter Druck und Kontrolle Zellen werden unter Verwendung des quantifizierten ImageJ Software (NIH).
- Die Neuriten als Axone oder Dendriten identifiziert werden. Um die morphologischen Veränderungen in den Axonen oder Dendriten beurteilen beschriebenen Experimenten oben kann durch Verwendung von Antikörpern Erfassen jeder Struktur wiederholt werden, dh, Neurofilament (NF)-Antikörpers zur Axonen und Mikrotubulus-assoziiertes Protein (MAP2) Antikörpers zur Dendriten.
- Mikrotubuli sind eine der wichtigsten Komponenten des Cytoskeletts von Neuronen, und der Schaden an Mikrotubuli als Marker von neuronalen Verletzungen eingesetzt. 2 Microtubule visualisiert werden kann unter Verwendung des immunofluorescently β-Tubulin-Antikörper. Zellen werden nach 0 und 24 h nach der Druckbeaufschlagung fixiert, gefärbt mit β-Tubulin-Antikörper, und beobachtet von dem Fluoreszenzmikroskop.
- Um die Wirkung von impulsiven Druckbeaufschlagung auf neuronale und apoptotischen Genexpression zu beurteilen, wird Gesamt-RNA aus einer unter Druck und Kontrolle Zellen extrahiert. Gene Expression kann durch Durchführen quantitativer RT-PCR oder Echtzeit-RT-PCR, ähnlich unserer veröffentlichten Protokollen untersucht werden. 3
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Ein Beispiel Druckprofils, die an die Zellen innerhalb der Druckkammer. Die Kolsky bar Vorrichtung erfolgreich erzeugt 2 MPa Ebene Einzelpuls-Typ treibend Druckbeaufschlagung mit einer Dauer von ungefähr 0,7 ms.
Abbildung 2. Ein Beispiel neuronale Zellantwort auf treibend Druckbeaufschlagung. SH-SY5Y-Zellen zu impulsiven Druckbeaufschlagung bei 2 MPa zeigen deutliche Neuriten / Axon Aufteilung gegenüber Kammer Kontrollzellen ausgesetzt.
6. Schwierigkeiten und Lösungen
- Chamber Abdichtung ist eines der größten Hindernisse zu überwinden. Es ist found dass große Festplatten mit O-Ringen ein Problem Fugenhobeln und erhöhte Reibung haben. Um die Reibung Effekte zu entfernen, sowie verhindern, Fugenhobeln, eine einfache Methode des Kolbens Tapen mit Teflon Klempner Band verwendet wird. Dies löst die Probleme und produziert gewünschten Druck Höhe und Dauer.
- Pressurized Nervenzellen Verhalten, insbesondere bei der Beurteilung der sekundären TBI Mechanismus oder längerfristigen Auswirkungen, sollte sich nach einem langen Post-Inkubationszeit untersucht werden. Die zellhaltigen Kammer ausgesetzt ist, um potenziell unsterilen Bedingungen während der Bewegung des Kolsky bar, unter Druck, und Bewegen wieder zur Zellkultur Haube. Mit Pre-Sterilisation der Kammer Teile und ordnungsgemäßen Betrieb in der Montage / Demontage der Zelle-kultivierten Rutsche und Kammer im Inneren der Zellkultur Kapuze, längerfristige post-Inkubation ist möglich bis zu mehreren Wochen.
- Die Reproduzierbarkeit der Daten ist ein wichtiger Parameter bei der zellulären mechanische Stimulation Experimente. Für unser Gerät, das reproducibility in neuronalen Zellen-Reaktion bestimmt wird, wie gewünscht impulsive Druckbeaufschlagung Profil, sowohl in Druck-Höhe und Dauer, wird immer wieder erhalten. Da wir die erhaltene Druckprofil für jede Druckbeaufschlagung aufzeichnen können die Zell-Antwort-Daten vor unerwünschten Druckprofil danach manuell ausgeschlossen werden.
- Der gesamte Druck-Schritte, einschließlich Kammerbaugruppe, Transfer und montieren in der Kolsky bar, Druck-, Transfer-back, und Kammermusik Demontage, in weniger als 10 min. Die nächste Zelle kultivierten Folie kann sofort Druck nach dem vorherigen Druckbeaufschlagung. Somit kann eine ausreichende Anzahl von Experimenten Druckbeaufschlagung effizient durchgeführt werden. Unser Set-up verwendet 18 mm Durchmesser Deckgläser. Eine Druckbeaufschlagung Experiment nicht genügend Proteine für westliche Immunoblot aufgrund Substrat Größe (und zum Teil auch, weil einige der Druck Zellen sind tot). Über drei wiederholten Druckbeaufschlagung Experimente liefern Proteinmenge für immunobl erforderlichotting. Wiederum wird die Reproduzierbarkeit jedes Mal mit dem Druckprofil überprüft.
Discussion
Viele in vitro experimentellen Techniken zur Untersuchung von Gehirn Zellschäden in TBI Bedingungen versucht worden. Dazu gehören Neuron / Astrozyten Stretching, strömungsinduzierten Schubspannung, Gewicht fallen, Stift Platzwunde, Laser Durchtrennung, Lithotripsie, etc. 4,5 Es wurde davon ausgegangen, dass Kurzzeit-Überdruck eine dominierende physische Faktor für TBI ist. 6,7 Gerade , die Schockwelle der Explosion TBI besitzt eine Pulsdauer von einer Größenordnung von Millisekunden. 4 Basierend auf dieser Annahme und Beobachtung hat Barometer Kammer in der Lage transiente Druckbeaufschlagung entwickelt und verwendet für die Beurteilung Gehirnzelle Verhalten unter TBI Bedingungen. Zum Beispiel wurde in dem Fluid Schlagwerk Barotrauma Kammer ein Druckimpuls mit 20-30 ms langer Dauer und einem Spitzendruck von bis zu 0,5 MPa verwendet, um den menschlichen Gliazellen Verhalten unter TBI untersuchen. 6 kurzem VandeVord et al. 7 verwendete Metall Ballkontakt Barometer Kammer, um den Astrozyten Zelle zu untersuchenVerhalten unter TBI aber das Metall Ballkontakt mehrere Druckimpulse erzeugt. In dieser Studie haben wir eine neue Zelle Druckbeaufschlagungsvorrichtung, die single-pulse type impulsive Druckbeaufschlagung generiert entwickelt. Das Gerät wurde auf der Grundlage der Kolsky bar set-up, das als Material Prüfgerät in unserem 8 und anderen Studien verwendet wurde, entwickelt. 1,9 Die Kolsky bar die Materialprüfung Möglichkeit bei sehr hohen Laderate geändert wurde, um der Lage sein, Anwendung Einzelpuls-Typ Überdruck zu den kultivierten Zellen innerhalb der Druckkammer (Abbildung 1). Wir konnten erfolgreich steuern die Größe und Dauer des impulsiven Überdruck. Als Vertreter Zellantwort zeigten wir, dass bei 2 MPa Druck SH-SY5Y neuronalen Zellen anzuzeigen signifikante Neuriten und axonalen Verlust, drucklosen Kammer Kontrollzellen verglichen.
Zusammenfassend haben wir eine neue impulsive Zelle Druckbeaufschlagung unter Verwendung einer speziell entwickelten Kolskybar-Gerät und zeigte sein Potential den Einsatz in der Untersuchung neuronaler Zell-Antwort in TBI Bedingungen. Wir bemerken auch, dass diese Technik sehr vielseitig, dass jede Art von Zellen kann treibend Drücke an verschiedenen Höhe und Dauer auszusetzen ist. Daher kann die Vorrichtung verwendet, um das treibend druckinduzierten zellulären Mechanotransduktion Verhalten zu untersuchen, nicht nur von Schädigung der Zellen, sondern auch zum zwangsweisen Stimulation der Zellen in ihrer Funktion und Schicksal Bestimmung.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Finanzierungsquellen danken: Army-UNL Center for Trauma Mechanics (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Namas Chandra), UNL Layman Award (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells | |||
| 18 mm diameter glass coverslips | |||
| Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin | |||
| Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis | |||
| Kolsky bar impulsive pressurization device | |||
| Piston-cylinder cell pressurization chamber | |||
| Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston | |||
| Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar | |||
| General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.) |
References
- Kolsky, H. An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading. Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).
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