Summary
소설 충동 세포 가압 실험은 폭발 - 유도 외상성 뇌 손상의 분자 / 세포 메커니즘을 조사하기 위해 Kolsky 바 장치를 사용하여 개발되었습니다.
Abstract
소설 충동 세포 가압 실험은 폭발 유발 외상성 뇌 손상을 (외상성 뇌 손상) 조사 Kolsky 바 장치를 사용하여 개발되었습니다. 우리는 폭발 외상성 뇌 손상과 관련된 충동 가압는 체외에서 neuronal 세포에 적용하는 방법이 비디오 문서에 보여줍니다. 이것은 기록 된 세포 가압 챔버 내에서 전체 압력 역사와 함께 전문 Kolsky 바 장치에 의해 생성 잘 제어 압력 펄스를 사용하여 달성된다. 가압 neuronal 세포는 가압 한 후 즉시 검사, 또는 서로 다른 neurite 손실 친척을 유도 우리는 약 2 MPA에 그 충동 가압을 관찰 axonal / neurite 가지, neuronal 유전자 발현, apoptosis 등의 충동 가압의 장기적인 효과를 검토 할 더 incubated 아르 unpressurized 세포합니다. 우리 기술은 잘 제어 PR에서 뇌 세포의 충동 가압을 통해, 외상성 뇌 손상 폭발의 분자 / 세포 메커니즘을 조사 할 새로운 방법을 제공합니다크기와 기간을 essure.
Protocol
1. Neuronal 세포 배양
- neuronal 세포, astrocytes, 그들의 공동 문화 등 뇌 세포가 세포 모델로 사용할 수 있습니다. 타당성 데모로서, 셀 라인 neuronal 세포의 충동 가압이 제공됩니다.
- SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포 (ATCC, CRL-2266)은 18mm 직경의 유리 coverslips에 배양되어 있습니다. 셀 3의 밀도에 놓는 아르 × DMEM로 구성된 성장 미디어를 사용 10 3 셀 / cm 2 10% 태아 소 혈청과 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충. 세포 배양 유리 슬라이드는 37 ° C.에서 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 보관
- SH-SY5Y 세포의 neuronal 세포 분화를 구하려면 셀이 추가로 미디어를 7 일 동안 10 μM retinoic 산 (RA)로 보충 미디어와 취급 이틀마다 변경했습니다. 일 7, 세포는 가압 될 준비가 된 것입니다.
2. 가압 설비 : Kolsky 바
- Kolsky 바, 드1949 년 Kolsky 1 일까지 veloped, 매우 높은 로딩 속도에서 재료의 기계적 성질을 측정하기 위해 사용되었습니다. 장치는 바 사이의 접촉에 배치 샘플과 막대가 두 개로 구성되어 있습니다. 사건 표시 줄에 생성 된 응력 파, 파도가 반영하고 전송 파도로 분할 샘플로 전파합니다. 샘플에서 스트레스가 전송 파도에 비례합니다. 본 연구에서는, 우리는 설정 Kolsky의 두 바 사이에 위치 할 셀 가압 챔버를 사용합니다.
- 두 알루미늄 합금 바 (각 6 m 길이)를 정렬 황동 베어링에 의해 정지되며, 체외 세포 가압 챔버에서이 막대 사이에 끼어 있습니다. 상류 바 한쪽 끝에 고정 130파운드 질량과 사고 바 있습니다. 마찰 클램프가 원하는 펄스 기간을 제공하는 위치에 배치됩니다. 클램프의 관심을 유도하고 질량 및로드 지원 사이의 가위 잭을 강화함으로써, 사고 바 클램프 - 질량 섹션 사전-C입니다원하는 수준 ompressed. 유압 시스템에 갑자기 휴식에 클램프를 잠급 노치 볼트를 강요하는 것은 빠르게 미리 저장된 압축을 출시하기 때문에 압력 펄스를 생성합니다. 이 사건 바을 통해 전파, 테스트 챔버 피스톤 드라이브, 충동 챔버 내의 유체 및 세포를 pressurizes. 차례로 챔버 압력은 전송 바 하류에 전파 압력 펄스를 시작합니다. 바에서의 압력 펄스와 관련된 변종이 45 볼트에 흥분 복합 높은 저항 스트레인 게이지로 측정하고 있습니다. 게이지 신호는로드의 역사 제 1 MHz의 주파수에서 디지털 오실로스코프로 기록됩니다.
- 체외 세포 가압 챔버에서는 피스톤 실린더로 구성되어 있습니다. 실린더는 2.6 cm 내부 직경 3.8 cm 외경을 가지고 있으며, 캐비티의 밑바닥에 도청 작은 구멍이 있습니다. 그 구멍은 세포 샘플 설치하는 동안 공기와 과도한 유체 배출구 역할을합니다. 피스톤은 7.5 cm 길이와 동일한 바 소재로 만들어진다. 피스톤은 낮은 마찰 인감의 역할 배관공 (테플론) 테이프 2 ~ 3 층으로 싸여 있습니다. 엔드 캡은 오래 32mm이며, 로딩 중에 유리 coverslips을 (세포 배양되는에) 확보 두 개의 작은 스테인레스 스틸 나사가 있습니다.
3. Neuronal 셀의 충동 가압
- 모든 가압 챔버 부품은 압력솥을 사용하여 소독하고 UV 빛 아래에서 유지됩니다. 챔버의 조립은 세포 배양 후드 안쪽에 수행됩니다. 챔버의 배기 나사가 느슨하게 구멍의 밑바닥에 공기에 종사하고 있습니다. 사전 예열 (37 ° C) 신선한 성장 미디어 거품을하지 않고 챔버에 pipetted 있습니다. 그런 다음 셀 배양 유리 슬라이드는 픽업하고 있으며, (외부에 직면 세포) 피스톤의 뚜껑에 표시됩니다. 작은 보유 나사는 그 자리에 개최 할 수있는 슬라이드에 아래로 강화됩니다. 세포 배양 유리 슬라이드와 피스톤 삽입 조금 전n 인물 챔버의 구멍, 그리고 어셈블리가 가장 높은 지점에서되는 통풍구를 기울입니다. 배기 나사가 제거되고 피스톤을 먼저 한 다음 기포, 과도한 유체를 강요 구멍에 밀어 있습니다. 어느 참조 마크 나 지그는 모든 테스트에 동일한 문화 미디어 볼륨을 보장하기 위해 가이드로 사용됩니다. 챔버에있는 미디어의 축 크기가 6mm에 있습니다. 배기 나사를 살균하고 꽉 챔버 물을 만들기 위해 그것을 교체하십시오. 챔버는 않는 경우, 테플론 랩이 교체하거나 강화해야 할이 정적 하중에 따라 누출해서는 안됩니다.
- 이 시점에서, Kolsky 바 시스템이 재설정됩니다. 무거운 질량은 원래의 위치로 다시 이동하고 새로운 잠금 볼트는 사용 된 (깨진)를 대체합니다. 약 200 PSI에 유압으로 새로운 잠금 볼트를 유도합니다. 원하는 값보다 약간 높은 압력으로 사건 바의 사전로드 섹션을 압축 가위 잭을 사용하고, 다음의 전체 마찰을 참여 할을 백업잭의 나사. 데이터 수집은 이제 무장되어 있습니다.
- 조립 셀 가압 챔버는 시스템에 장착된다. 그것은 작은 실험실 가위 잭에서 지원하는 V 블록에 배치하고 두 개의 막대로 정렬되어 있습니다. 가벼운 기름 층 사이에 에어 갭을 제거하는 함께 간섭 표면을 문질러과 그리스 각 인터페이스에서 수행 할 수 있습니다.
- 시험은 이제 시작 할 준비가되어 있습니다. 클램프 잠금 볼트는 빠르게 유압 클램프 드라이버를 펌핑하여 침입을 강요하고 있습니다. 결과를 클램프가 분리되며 데이터 수집이 표시됩니다. 세포 가압 내역은 전송 바 게이지의 측정에서 결정됩니다. 사용 된 전송 표시 줄이 충분히 인 경우 측정이 부정적인 압력을 게재 위치이는 지점에 첫 번째 장애에서해야합니다. 거품이 덫 경우 전송 펄스의 기간은 사건 펄스보다 짧을 수 있습니다. 크기는 사건 펄스의 도달하지 않을 수 있습니다,하지만 충분히 경도가 있어야합니다하역하기 전에 g 고원. 그렇지 않으면, 밀봉 된 챔버 또는 어셈블리 및 바 사이의 misalignment에서 큰 기포 하나가 발생했을 수도 있습니다.
- 세포 가압 챔버 그런 다음 제거하고 세포 배양 후드 내부 분해된다. 배기 나사가 제거되고 피스톤이 챔버의 무료 당겨 있습니다. 세포 배양 유리 슬라이드는 피스톤의 끝에서 가져옵니다.
4. 가압 셀 행동을 평가
- 가압 후, 세포는 즉시 검사 할 수 있습니다 또는 더 이상 시험을 incubated. 적절한 무균 조작 과정을 통해 장기적 후 부화이 가능합니다.
- 가압 셀은 모든 분자와 세포 생물학 기법을 면밀히 검토 할 수 있습니다. 특히 neuronal 세포 가압를 들어, assays는 neurite 가지의 압력 유발 변경, 미세 소관 cytoskeletal 변화, neuronal 유전자 expre을 평가, 외상성 뇌 손상 조건에서 세포와 분자 생리학을 조사 할 수ssion, apoptosis 등은 수행 할 수 있습니다. 제어 세포 샘플, 동일한을 배양 아르 세포는 같은 기간 동안 가압 챔버 내부에 보관하지만, 가압되지는 (그래서, 챔버 제어를 호출)를 사용 때문입니다.
- neurite 가지의 변화를 평가를 들어, 가압 및 챔버 제어 셀은 즉시 가압 및 사후 부화의 1, 24 H 후 광학 현미경으로 검사합니다. neuronal 세포 이미지의 예는 '대표 결과'섹션 (그림 2)에 표시됩니다. neurite 길이 변경 고를 immunofluorescent 착색 및 이미지 분석하여 정량화 할 수 있습니다. 셀은 0.05 % V / V 트윈-20 세척 버퍼로 헹구어 4 % W / V paraformaldehyde 솔루션으로 고정하고, 0.1 % 브이 / v 튼 X-100 솔루션을 permeabilized 있습니다. 1 % w / v를 소 혈청 알부민 솔루션으로 차단 한 후에 세포 tetramethylrhodamine의 isothiocyanate (TRITC) - 복합 phalloidin와 incubated 수 있습니다. 셀의 Immunofluorescent 이미지는 형광등을 사용하여 이동합니다현미경과 가압 및 제어 세포에 대한 neurites의 길이는 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 평가합니다.
- neurites는 axons 또는 수석으로 식별 할 수 있습니다. axons 또는 수석의 형태학의 변화를 평가하기 위해 실험 위에서 설명한 각 구조를 검출 항체를 사용하여 반복 할 수 있습니다, 즉 수석에 대한 axons와 미세 소관 - 관련 단백질 (MAP2) 항체에 대한 neurofilament (NF) 항체.
- 미소는 뉴런의 핵심 cytoskeletal 구성 요소 중 하나이며, 미소에 손상 neuronal 부상의 마커로 사용되었습니다.이 미세 소관은 β-tubulin 항체를 사용하여 immunofluorescently 시각화 할 수 있습니다. 셀은 후 가압 0, 24 H 후 고정 β-tubulin 항체 물들과 형광 현미경에 의해 관찰된다.
- neuronal 및 apoptotic 유전자 발현에 대한 충동 가압의 효과를 평가하기 위해, 총 RNA는 가압 및 제어 세포에서 추출됩니다. 일반전자의 발현은 우리의 게시 된 프로토콜과 유사 정량 RT-PCR 또는 실시간 RT-PCR을 수행하여 검사를 할 수 있습니다. 3
5. 대표 결과 :
그림 1. 압력 프로파일의 예는 가압 챔버 내에서 세포에 적용. Kolsky 바 장치를 성공적으로 0.7에 대한 MS의 기간이있는 2 MPA 수준, 단일 펄스 타입 충동적인 가압를 생성합니다.
그림 2. 충동 가압에 neuronal 세포 응답의 예라고 할 수 있습니다. SH-SY5Y 세포는 챔버 제어 세포에 비해 두 MPA 쇼 독특한 neurite / 축삭 고장에서 충동 적 가압에 노출.
6. 어려움과 솔루션
- 상공 회의소 실링은 극복 할 주요 장애물 중 하나입니다. 그것은 강한 것입니다O-링과 다양한 디스크 가우 징 및 증가 마찰의 문제를 가지고 놀이. 마찰 효과를 제거뿐만 아니라 가우 징, 테플론 배관 테이프 피스톤 녹음의 간단한 방법을 방지하기 위해 사용됩니다. 이 문제를 해결하여 원하는 압력 수준과 기간을 생산하고 있습니다.
- 가압 neuronal 세포 행동은, 보조 외상성 뇌 손상 메커니즘이나 장기적 효과를 평가 특히 오랜 후 배양 시간 후에 검사해야합니다. 세포 함유 챔버는 Kolsky 바로 이동 pressurizing 및 세포 배양 후드로 다시 이동하는 동안 잠재적 인 조건을 unsterile에 노출되어 있습니다. 챔버 부품 및 / 분해 세포 배양 후드 내부의 세포 배양 슬라이드와 챔버의 조립에 적절한 작업의 사전 살균을 통해 장기적인 후 부화는 몇 주까지 가능합니다.
- 데이터의 재현성 세포 기계 자극 실험에서 중요한 매개 변수입니다. 우리의 장치 reproducibilit에 대한neuronal 세포 응답의 Y는 충동 적 가압 프로필을 원하는 방법을 결정, 압력 수준과 기간 모두에서 반복적으로 얻어진다. 우리가 각 가압 용 얻은 압력 프로파일을 기록하기 때문에, 원치 않는 압력 프로필에서 세포 응답 데이터를 수동으로 나중에 제외 할 수 있습니다.
- 챔버 조립, 전송 및 Kolsky 바, 가압, 전송 - 다시, 그리고 챔버 분해에 마운트를 포함한 전체 가압 단계는, 이하의 10 분을. 다음 세포 배양 슬라이드는 이전 가압 후 바로 가압 될 수 있습니다. 따라서, 가압 실험의 충분한 수를 효율적으로 완료 할 수 있습니다. 우리의 설정은 18mm 직경 유리 coverslips을 활용합니다. 하나의 가압 실험은 기판의 크기로 인해 immunoblotting 서쪽에 충분한 단백질을 (그리고 또한 부분적으로 가압 세포의 일부가 죽었 때문에) 제공하지 않습니다. 세명의 반복 가압 실험은 immunobl에 필요한 단백질 양을 제공합니다otting. 다시 말하지만, 재현성이 압력 프로필로 할 때마다 검사합니다.
Discussion
체외 실험 기술의 대부분은 외상성 뇌 손상 조건에서 뇌 세포 손상을 공부를 위해 시도되었습니다. 이러한 이것은 짧은 기간 과압이 외상성 뇌 손상에 대한 지배 물리적 요소입니다 것으로 간주되었습니다 / astrocyte 스트레칭, 흐름 유도 전단 응력 신경 세포, 체중 드롭, 스타일러스가 찢어진, 레이저 절개, lithotripsy 등 4,5이 포함되어 있습니다. 특히 6,7를 , 외상성 뇌 손상 폭발의 충격파는 밀리 초의 주문 펄스 기간이 있습니다. 4 이러한 가정하고 관찰을 바탕으로, 과도 가압 할 수있는 기압계 챔버는 개발 및 외상성 뇌 손상 조건 하에서 뇌 세포의 행동을 평가에 사용되었습니다. 예를 들어, 유체 타악기 barotrauma 챔버 0.5 MPA에 20-30 밀리 긴 기간 및 최대 피크 압력과 압력 펄스에 외상성 뇌 손상에서 인간 glial 세포의 동작을 검사하는 데 사용되었다. 6 최근 VandeVord 외 7. 사용 금속 astrocyte 세포를 검사하기 위해 볼 인상적인 기압계 챔버외상성 뇌 손상에 따라 행동하지만, 금속 공을 여러 압력 펄스를 생산 놀라운. 본 연구에서는, 우리는 단일 펄스 타입 충동적인 압력을 생성하는 새로운 세포 가압 장치를 개발했습니다. 장치는 우리의 8 기타의 연구 재료 시험 장치로 사용 된 Kolsky 바 설정을 기반으로 개발되었습니다. 매우 높은 로딩 속도 1,9 Kolsky 바의 재료 시험 기능을 할 수 있다는 것이 수정되었습니다 가압 챔버 (그림 1)에서 배양 세포에 단일 펄스 형 압력을 적용합니다. 우리는 성공적으로 충동적인 압력의 크기와 기간을 조절할 수 있습니다. 대표 셀 응답, 우리는 unpressurized 챔버 제어 세포에 비해 두 MPA 압력 SH-SY5Y neuronal 세포에서 중요한 neurite 및 axonal 손실을 표시 보여 주었다.
결론적으로, 우리는 특별히 고안된 Kolsky을 사용하여 새로운 충동 셀 가압 장치를 개발바 장치와는 외상성 뇌 손상 조건에서 neuronal 세포 반응을 조사에 잠재적 인 사용을 보여 주었다. 우리는 또한이 기술은 세포의 종류가 다양한 수준과 기간에 충동 적 압력에 노출 될 수 있다는 매우 다양한됩니다. 따라서 장치는 세포의 손상뿐만 아니라 적극적으로 자신의 기능과 운명 결정에 세포를 자극 용뿐 아니라, 충동 적 압력 유발 세포 mechanotransduction의 동작을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
외상 기계를위한 육군-UNL 센터 (국방부 / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI : 박사 Namas 찬드라), UNL 뜻하는 상 (26-1110-0033 -001 저자는 자금 소스를 감사드립니다 , PI : 임).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells | |||
| 18 mm diameter glass coverslips | |||
| Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin | |||
| Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis | |||
| Kolsky bar impulsive pressurization device | |||
| Piston-cylinder cell pressurization chamber | |||
| Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston | |||
| Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar | |||
| General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.) |
References
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