Summary
Een nieuwe impulsief cel onder druk experiment is ontwikkeld met behulp van een Kolsky bar apparaat op de moleculaire / cellulaire mechanismen van blast-geïnduceerde traumatisch hersenletsel te onderzoeken.
Abstract
Een nieuwe impulsief cel onder druk experiment is ontwikkeld met behulp van een Kolsky bar apparaat om blast-geïnduceerde traumatisch hersenletsel (TBI) te onderzoeken. We tonen in dit artikel hoe video blast TBI relevante impulsieve onder druk wordt toegevoerd aan de neuronale cellen in vitro. Dit is mogelijk door goed gecontroleerde drukpuls gecreëerd door een gespecialiseerd apparaat Kolsky bar met volledige luchtdrukwaarden in de cel opgenomen overdruk kamer. Druk neuronale cellen onmiddellijk geïnspecteerd na pressurisatie, of verder geïncubeerd om de lange termijn effecten van impulsieve onder druk op neuriet / axonale uitgroei neuronale genexpressie, apoptose, etc. Het verdient impulsieve overdruk waargenomen bij ongeveer 2 MPa onderzoeken induceert afzonderlijke neurieten verlies ten opzichte om zonder drukcabine cellen. Onze techniek verschaft een nieuwe werkwijze om de moleculaire / cellulaire mechanismen van blast TBI onderzoeken, via impulsieve druk zetten van hersencellen bij goed gecontroleerde prEssure omvang en duur.
Protocol
1. Neuronal Cell Culture
- Hersencellen waaronder neuronale cellen, astrocyten, en hun co-cultuur kan worden gebruikt als een cel model. Als haalbaarheid demonstratie, is impulsief onder druk van cel-lijn neuronale cellen gepresenteerd.
- SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen (ATCC, CRL-2266) gekweekt op 18 mm dekglaasjes diameter. Cellen worden uitgezaaid bij een dichtheid van 3 x 10 3 cellen / cm 2 met de groeimedia uit DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine. Cell gekweekte glazen dia's worden bewaard in een 5% CO 2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
- Om de neuronale cel differentiatie van SH-SY5Y cellen te verkrijgen, cellen werden behandeld met media verder aangevuld met 10 pM retinolzuur (RA) gedurende 7 dagen met media veranderd elke twee dagen. Op dag 7 cellen bereid onder druk.
2. Overdruk Uitrusting: Kolsky Bar
- De Kolsky bar, dewikkeld door Kolsky 1 in 1949, is gebruikt om de mechanische eigenschappen van een materiaal te meten op een zeer hoge belasting tarief. De inrichting bestaat uit twee staven met een monster in contact tussen de spijlen. Een drukgolf, gemaakt op het incident bar, propageert naar het monster waar de golf zich opsplitst in een gereflecteerde en doorgelaten golf. De spanning in het monster is evenredig aan de doorgelaten golf. In deze studie hebben we gebruik maken van een cel onder druk kamer worden geplaatst tussen de twee bars van de Kolsky set-up.
- De twee aluminium staven (elk 6-m lang) worden geschorst door uitgelijnd messing lagers, en een in vitro cel onder druk kamer wordt ingeklemd tussen de balken. De upstream bar is het incident bar met een 130 pond massa geklemd ene uiteinde. Een wrijving klem wordt geplaatst op een positie die de gewenste pulsduur geven. Door het inschakelen van de klem en aandraaien van een schaar jack tussen de massa en een steunvel, de klem-sectie massa van het incident bar pre-compressed op het gewenste niveau. Waardoor een getande bout die de klem blokkeert een plotselinge breuk met een hydraulisch systeem geeft de vooraf opgeslagen compressie snel en brengt derhalve een drukpuls. Deze plant zich voort door het incident bar, drijft de testkamer zuiger, en onder druk van de vloeistof en cellen in de kamer impulsief. De kamer onder druk beurt zet een drukpuls voortplant in de downstream uitgezonden bar. De stammen die geassocieerd zijn met de druk pulsen in de bars worden gemeten met de samengestelde hoge weerstand rekstrookjes enthousiast tot 45 volt. De meter signalen worden opgenomen met een digitale oscilloscoop bij 1 MHz frequentie als een laad-geschiedenis.
- De in vitro cel onder druk kamer bestaat uit een zuiger-cilinder. De cilinder heeft 2,6 cm binnendiameter en buitendiameter 3,8 cm, en heeft een gaatje afgetapt aan de basis van de holte. Het gat dient als een lucht-en overtollig vocht ventilatie tijdens celmonster installatie. De zuiger is 7,5 cm langen is gemaakt van hetzelfde materiaal bar. De zuiger is omwikkeld met twee tot drie lagen (Teflon) loodgieter tape die als lage wrijving afdichting. De eindkap is 32 mm lang en heeft twee kleine roestvrij stalen schroeven die de dekglaasjes (waarop cellen worden gekweekt) veilig tijdens het laden.
3. Impulsief druk zetten van neuronale cellen
- Alle onder druk kamer delen worden gesteriliseerd met behulp van de autoclaaf en worden gehouden onder UV-licht. Het samenstel van de kamer wordt uitgevoerd binnen de celkweek kap. De ontluchtingsschroef in de kamer wordt losjes betrokken bij de ontluchter aan de basis van de holte. Voorverwarmde (37 ° C) vers groeimedium wordt gepipetteerd in de kamer zonder luchtbellen. Vervolgens wordt een cellenkweek glasplaatje opgehaald en geplaatst op de dop van de zuiger (cellen naar buiten). De kleine bevestigingsschroeven worden vastgezet op de glijbaan te houden op zijn plaats. De zuiger met een cellenkweek glasplaatje toegevoegd iets into de holte van de kamer, en het samenstel wordt gekanteld dat de ontluchting op het hoogste punt. De ontluchtingsschroef wordt verwijderd en de zuiger wordt gedrukt in de holte eerste verdringen luchtbellen wordt de overtollige vloeistof. Ofwel een merkteken of een mal wordt gebruikt als een gids voor de dezelfde cultuur media volume voor elke test te garanderen. De axiale afmeting van de media in de kamer is ongeveer 6 mm. Sanitize de ontluchtingsschroef en vervang deze door naar de kamer waterdicht te maken. De kamer mag niet lekken onder deze statische belasting, als dat zo is, de Teflon wrap moet worden vervangen of versterkt.
- Op dit punt, de Kolsky bar systeem gereset. De zware massa wordt verplaatst naar de oorspronkelijke positie en een nieuwe grendel vervangt gebruikt (gebroken) een. Zet de nieuwe borgbout met de hydraulica tot ongeveer 200 psi. Gebruik de schaar jack naar de pre-loading gedeelte van het incident bar te comprimeren tot een druk iets hoger dan de gewenste waarde, en dan terug het af om de volledige wrijving van het betrekkenjack's schroef. De data acquisitie is nu ingeschakeld.
- De geassembleerde cel onder druk kamer is gemonteerd in het systeem. Het is geplaatst in een V blok ondersteund door kleine lab schaar jack en uitgelijnd met de twee staven. Vet elke interface met een lichte vetlaag en samen wrijf de oppervlakken stoten aan een luchtspleten tussen elimineren.
- De test kan nu doorgaan. De klem grendel wordt gedwongen om te breken door snel pompen van de hydraulische klem driver. De klem zal scheiden en de data-acquisitie moet worden weergegeven van de resultaten. De cel onder druk geschiedenis bepaald uit de metingen van de uitgezonden bar overdruk. Als de gebruikte uitgezonden bar lang genoeg dient deze slechts van de eerste verstoring van het punt waar de metingen een negatieve druk. De duur van de uitgezonden puls kan korter zijn dan het incident puls als een bel wordt gevangen. De omvang niet bereiken die van de invallende puls, maar moet een voldoende long plateau vóór het lossen. Anders kan ofwel een grote luchtbel in de verzegelde kamer of een onbalans tussen de montage en een bar zijn opgetreden.
- De cel onder druk kamer wordt vervolgens verwijderd en gedemonteerd in de celkweek kap. De ontluchtingsschroef wordt verwijderd en de zuiger is losgetrokken van de kamer. De cel-gekweekte glasplaatje wordt gerekend vanaf het uiteinde van de zuiger.
4. Het beoordelen van onder druk cel gedrag
- Na pressurisatie, kunnen de cellen direct worden geïnspecteerd of verder geïncubeerd later onderzoek. Met de juiste aseptische operationele processen, op langere termijn na de incubatie is mogelijk.
- Druk cellen kunnen worden onderzocht door alle moleculaire en cellulaire biologie technieken. Specifiek voor neuronale cellen onder druk, om de cellulaire en moleculaire onderzoeken in fysiologie TBI omstandigheden assays beoordelen druk geïnduceerde veranderingen in neurietuitgroei, microtubule cytoskelet verandering neuronale gen expression, apoptose, etc., worden uitgevoerd. Als controle celmonsters, cellen die gekweekt hetzelfde gehouden binnen de onder druk kamer voor dezelfde tijdsperiode, maar niet onder druk worden gebruikt (zogenaamde, kamer control).
- Ter beoordeling van de veranderingen in neurietgroei worden druk en kamer controle cellen onderzocht door optische microscoop onmiddellijk na pressurisatie en 1 en 24 h na incubatie. Een voorbeeld van neuronale cel beelden worden getoond in de "Representatieve resultaten sectie (figuur 2). De neurite lengteverandering kan worden gekwantificeerd door actine immunofluorescente kleuring en beeldanalyse. Cellen gefixeerd met 4% w / v paraformaldehyde oplossing gespoeld met 0,05% v / v Tween-20 wasbuffer en gepermeabiliseerd met een 0,1% v / v Triton X-100 oplossing. Na het blokkeren met 1% w / v runderserumalbumine oplossing worden cellen geïncubeerd met tetramethylrhodamine isothiocyanaat (TRITC)-geconjugeerd phalloidin. Immunofluorescentie beelden van de cellen genomen met een fluorescentmicroscoop en de lengte van neurieten voor druk en controle cellen gekwantificeerd met de ImageJ software (NIH).
- De neurieten kan worden geïdentificeerd als axonen of dendrieten. De morfologische veranderingen in axons of dendrieten beoordelen, de hierboven beschreven experimenten worden herhaald met behulp van antilichamen detecteren van elke, nl. neurofilament (NF) antilichaam axonen en microtubule-geassocieerd eiwit (MAP2) antilichaam voor dendrieten.
- Microtubuli zijn een van de belangrijkste componenten van het cytoskelet neuronen, en de schade aan microtubuli is gebruikt als een merker van neuronale schade. Microtubule 2 kan worden gevisualiseerd immunofluorescently met de β-tubuline antilichaam. Cellen gefixeerd na 0 en 24 uur post overdruk, gekleurd met β-tubuline antilichaam en waargenomen door de fluorescentiemicroscoop.
- Om het effect van impulsieve onder druk op neuronale en apoptotische genexpressie te beoordelen, wordt totaal RNA geëxtraheerd uit druk en controle cellen. Gene expressie kan worden onderzocht door het uitvoeren van kwantitatieve RT-PCR of real-time RT-PCR, vergelijkbaar met gepubliceerde protocollen 3.
5. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Een voorbeeld van drukprofiel bij de cellen in de kamer onder druk. De Kolsky bar apparaat genereert succes 2 MPa niveau, een enkele puls soort impulsieve onder druk met een duur van ongeveer 0,7 ms.
Figuur 2. Een voorbeeld van neuronale cel respons op impulsieve overdruk. SH-SY5Y cellen blootgesteld aan impulsieve onder druk van 2 MPa tonen verschillende neuriet / axon afbraak ten opzichte van de kamer controle cellen.
6. Moeilijkheden en oplossingen
- Kamer afdichting is een van de belangrijkste obstakels worden overwonnen. Het found die grote schijven met o-ringen een probleem van kerving en verhoogde wrijving hebben. Om de wrijving te verwijderen en te voorkomen kerving, een eenvoudige methode zuiger tape met Teflon tape loodgieter gebruikt. Dit lost de problemen en produceert gewenste drukniveau en duur.
- Onder druk neuronale cel gedrag, in het bijzonder bij de beoordeling van secundaire TBI mechanisme of langere termijn effecten, moet worden onderzocht na een lange post-incubatietijd. De cel-bevattende kamer wordt blootgesteld aan potentieel steriele omstandigheden tijdens het verplaatsen naar de Kolsky bar druk, en terug naar de celkweek kap. Met pre-sterilisatie van de kamer delen en de goede werking van montage / demontage van de cel-gekweekte glijbaan en ruimte in de cel cultuur kap, op langere termijn na de incubatie is mogelijk tot enkele weken.
- De reproduceerbaarheid van de gegevens is een belangrijke parameter in cellulaire mechanische stimulatie experimenten. Voor ons apparaat, de reproducibility in neuronale cel respons wordt bepaald hoe gewenst impulsief onder druk profiel, zowel in druk en-duur, wordt herhaaldelijk verkregen. Omdat we nemen de verkregen drukprofiel voor elke onder druk, kan de cel respons data van ongewenste drukprofiel later handmatig worden uitgesloten.
- De gehele onder druk stappen, met inbegrip van de kamer assemblage, overdracht en monteren in de Kolsky bar, onder druk, transfer-back, en kamer demontage, in minder dan 10 minuten. De volgende cel gekweekte dia kan onmiddellijk onder druk na de vorige druk zetten. Aldus kan voldoende overdruk experimenten efficiënt uitgevoerd. Onze set-up maakt gebruik van 18 mm diameter glas dekglaasjes. Een onder druk experiment levert niet genoeg eiwitten voor de westerse immunoblotting het oppervlak tengevolge van grootte (en ook deels omdat een aantal van de onder druk staande cellen zijn dood). Ongeveer drie herhaalde onder druk experimenten leveren eiwit hetgeen noodzakelijk is voor immunoblOtting. Opnieuw wordt de reproduceerbaarheid gecontroleerd telkens met het drukprofiel.
Discussion
Velen in vitro experimentele technieken zijn uitgeprobeerd voor het bestuderen van de hersenen celbeschadiging in TBI omstandigheden. Deze omvatten neuron / astrocyten strekken, stromingsgeïnduceerde schuifspanning gewicht drop, stylus scheuren, laser transsectie lithotripsie, etc. 4,5 Aangenomen wordt dat kortstondige overdruk is een dominante factor voor fysieke TBI. 6,7 Vooral , de schokgolf van de explosie TBI heeft een pulsduur van een orde van milliseconden. 4 Gebaseerd op deze veronderstelling en waarneming, heeft barometer kamer staat voorbijgaande onder druk ontwikkeld en gebruikt voor de beoordeling van de hersenen cel gedrag onder TBI omstandigheden. Zo is in het fluïdum percussie barotrauma kamer een drukpuls met 20-30 ms lange duur en een piekdruk van 0,5 MPa gebruikt om de humane gliale cel gedrag onderzocht onder TBI. 6 Onlangs, VandeVord et al.. 7 gebruikt metal bal opvallende barometer kamer naar de astrocyten cel te onderzoekengedrag onder TBI, maar de metalen bal opvallend geproduceerd meerdere drukpulsen. In deze studie hebben we een nieuwe cel overdruk apparaat dat een enkele puls soort impulsieve onder druk genereert. Het apparaat is ontwikkeld gebaseerd op de Kolsky bar set-up, die is gebruikt als materiaal testapparaat in onze 8 en ander studies. 1,9 bar Kolsky het materiaal van testmogelijkheden zeer hoge densiteit is aangepast om te kunnen toepassing single-pulstype overdruk aan de gekweekte cellen in de kamer onder druk (figuur 1). We konden met succes de controle van de omvang en de duur van de impulsieve overdruk. Als vertegenwoordiger celrespons hebben we aangetoond dat bij 2 MPa SH-SY5Y neuronale cellen significant neurieten en axonaal verlies weer vergeleken met controle cellen drukloos kamer.
Tot slot hebben we een nieuwe impulsieve cel onder druk apparatuur met behulp van een speciaal ontworpen Kolskybar apparaat en toonde zijn potentieel gebruik bij het onderzoek naar neuronale cel respons in TBI omstandigheden. We merken ook op dat deze techniek zeer veelzijdig in dat elk type cellen worden blootgesteld aan impulsieve druk op verschillende niveau en duur. Daarom kan het apparaat worden gebruikt om de impulsieve druk-geïnduceerde cellulaire mechanotransductie gedrag onderzoeken, niet alleen voor verwonden de cellen ook positief voor het stimuleren van de cellen in hun functie en lot bepalen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de financieringsbronnen bedanken: Army-UNL Center for Trauma Mechanica (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr Namas Chandra), UNL Layman Award (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells | |||
| 18 mm diameter glass coverslips | |||
| Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin | |||
| Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis | |||
| Kolsky bar impulsive pressurization device | |||
| Piston-cylinder cell pressurization chamber | |||
| Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston | |||
| Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar | |||
| General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.) |
References
- Kolsky, H. An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading. Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).
- Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration. FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).
- Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics. Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).
- Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).
- Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).
- Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury. J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).
- VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).
- Huang, H., Feng, R. A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment. Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).
- Song, B., Chen, W. Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials. Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).
