外傷性脳損傷の研究のための神経細胞のインパルス加

Summary

小説衝動的なセルの加圧実験は爆発誘発外傷性脳損傷の分子/細胞のメカニズムを調べるためにKolskyバーのデバイスを使用して開発されました。

Abstract

小説衝動的なセルの加圧実験は爆発誘発性外傷性脳損傷（TBI）を調査するためにKolskyバーのデバイスを使用して開発されました。我々は、爆風TBI関連の衝動的な加圧はin vitroで神経細胞にどのように適用されるかこのビデオの記事で実証している。これは、記録されたセルの加圧室内に完全な圧力履歴と、専門Kolskyバー装置によって作成された十分に制御された圧力パルスを用いることにより達成される。加圧された神経細胞は加圧後直ちに検査、またはさらなる神経突起/軸索伸長、ニューロンの遺伝子発現、アポトーシスなどに衝動的な加圧の長期的な影響を調べるためにインキュベートされる私たちは、約2 MPaでその衝動的な加圧を観察した別個の神経突起の損失の相対を誘導加圧されていない細胞に。我々の技術は十分に制御されたPRで、脳細胞の衝動的な加圧を介して、TBIの爆発物の分子/細胞メカニズムを調査するための新規な方法を提供する大きさと持続時間をessure。

Protocol

1。神経細胞培養

1. 神経細胞、アストロサイト、およびそれらの共培養を含む脳細胞は細胞モデルとして使用することもできる。実現可能性の実証として、細胞株の神経細胞の衝動的な加圧が提示されます。
2. SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞（ATCC、CRL-2266）は、18ミリメートル直径のガラスカバースリップ上で培養されています。細胞をDMEMから成る増殖培地を用いて^{、2 3×10} 3個/ cmの密度で播種し、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充した。細胞培養したガラススライドを37℃で5％CO _2の加湿インキュベーター内に保持され
3. SH-SY5Y細胞の神経細胞分化を得るためには、細胞をさらにメディアで7日間10μMのレチノイン酸（RA）を補充した培地で処理して2日ごとに変更されました。 7日目に、細胞が加圧されることができる状態になります。

2。加圧装置：Kolskyバー

1. Kolskyバー、デ1949年Kolsky ¹ velopedによって、非常に高い負荷率で材料の機械的特性を測定するために用いられてきた。この装置は、バーとバーの間に接触して配置された試料を持つ2つの棒グラフで構成されます。インシデント·バー上に作成し、応力波は、波が反射および透過波に分割サンプルに伝播します。サンプル中のストレスは、送信波に比例します。そこで本研究では、セットアップKolskyの2小節分の間に配置されるセル加圧室を利用しています。
2. 2つのアルミニウム合金棒（各6メートル長い）が整列真鍮ベアリングによって中断され、in vitro細胞加圧室内の棒の間に挟まれている。上流のバーは一端にクランプ130ポンドの質量を持つ入射バーです。摩擦クランプは、所望のパルス持続時間を与える位置に配置されている。クランプを係と質量と荷重支持体との間にはさみジャッキを締めて、入射バーのクランプの質量部は、事前-cです所望のレベルにompressed。油圧システムとの突然のブレークにクランプをロックノッチボルトを強制すると、急速に予め格納された圧縮を解放し、したがって圧力パルスを生成する。これは、入射バーを介して伝播し、試験室のピストンを駆動し、衝動的にチャンバー内の流体および細胞を加圧する。今度はチャンバー圧は、送信バー下流に伝播する圧力パルスを開始します。バールの圧力パルスに関連する株は45ボルトに興奮して化合物を高抵抗ひずみゲージで測定されます。ゲージ信号は荷重履歴として1 MHzの周波数でデジタルオシロスコープで記録されます。
3. in vitro細胞加圧室内のピストン·シリンダーで構成されています。シリンダーは2.6センチメートル内径と3.8センチメートル外径を有し、空洞の底でタップ小さな穴があります。穴は細胞サンプルのインストール時に空気と過剰流体口として機能します。ピストンは7.5センチですと同じ棒材から作られています。ピストンは低摩擦シールとして配管工の（テフロン）テープの2〜3層でラップされます。エンドキャップの長さは32 mmで、ロード時にカバーガラスを（細胞が培養されている）を固定している2小さなステンレス製のネジがあります。

3。神経細胞のインパルス加

1. すべての加圧室パーツはオートクレーブを用いて滅菌されており、紫外光の下で保存されています。チャンバーの組み立ては細胞培養用フード内で行われる。チャンバー内のベントスクリュが緩く空洞の根元に空気抜きを行っています。あらかじめ温めておいた（37℃）新鮮な増殖培地の気泡を作ることなく、チャンバー内に分注される。その後、細胞培養スライドガラスをピックアップされており、（外部に面する細胞）ピストンのキャップの上に配置されます。小さな持株ネジが所定の位置に保持するために、スライド上にダウンして締められている。細胞培養したスライドガラスを備えたピストンが挿入されている少し私NTO室の空洞、およびアセンブリは最高点であるベント傾いている。ベントスクリュが削除され、ピストンがまず気泡、余分な水分を押し出す空洞内に押し込まれる。いずれかの基準マークや治具は、すべてのテストのための同じ培地の量を確保するためのガイドとして使用されています。チャンバー内のメディアの軸方向の寸法は約6mmです。ベントスクリュをサニタイズ密室水を作ってそれを交換してください。チャンバーは、それがない場合は、テフロンラップが交換または補強する必要があり、この静的荷重下で漏れないようにしてください。
2. この時点で、Kolskyバーシステムはリセットされます。重い質量は元の位置に戻され、新しいロックボルトは、（壊れた）使用されたものに置き換えられています。約200psiに油圧を使用して新しいロックボルトと係合する。所望の値より少し高い圧力に入射バーのプリローディングセクションを圧縮するためにはさみジャッキを使用し、その後の完全な摩擦係合するように、それをオフにバックアップジャックのネジ。データ収集は現在、武装している。
3. 組み立てセル加圧室は、システムにマウントされています。それは、小さなラボはさみジャッキで支えVブロックに配置され、二つのバーと整列している。グリース各インターフェイス光グリース層との間の任意のエアギャップを解消するために一緒に突合せ面をこする。
4. テストは続行する準備ができている。クランプロックボルトを素早く油圧クランプドライバをポンピングすることによって中断を余儀なくされている。クランプは分離され、データ収集、結果を表示する必要があります。セル加圧履歴を送信棒ゲージの測定値から決定されます。使用される送信バーが十分に長い場合、これが唯一の測定値が負圧を示すポイントへの最初の外乱からでなければなりません。気泡がトラップされている場合に送信されるパルスの持続時間は、入射パルスより短くなる場合があります。大きさは入射パルスのそれに達しないかもしれませんが、それは十分に経度を持つべきアンロードする前に、グラム台地。それ以外の場合は、密閉されたチャンバまたはアセンブリとバーの間に大きなずれ気泡のいずれかが発生した可能性があります。
5. 細胞の加圧室を除去し、細胞培養フード内に分解されました。ベントスクリュが削除され、ピストンをチャンバーの自由引っ張られる。細胞培養したスライドガラスは、ピストンの端から取られます。

4。加圧された細胞の挙動を評価する

1. 加した後、細胞をすぐに検査することができるか、さらに後で調べるインキュベートした。適切な無菌操作プロセスを使用すると、長期的なポストインキュベーションが可能です。
2. 加圧された細胞はすべての分子細胞生物学的手法により調べることができます。具体的にTBIの条件で細胞と分子の生理機能を調査するために神経細胞の加圧、神経突起伸長の圧力誘起変化を評価するアッセイ、微小管細胞骨格の変化、神経細胞の遺伝子expre用ssion、アポトーシスなどを行うことができます。対照細胞試料を、同じ培養される細胞は、同じ期間の加圧室の内部に保持しますが、加圧されていないが（そのため、制御室とも呼ばれます）使用されている。
3. 神経突起伸長の変化を評価するために、加圧及びチャンバコントロール細胞はすぐに加圧およびポストインキュベーションの1時間および24時間後に光学顕微鏡で観察されています。神経細胞の画像の例は "代表的な結果"セクション（図2）に示されている。神経突起の長さの変化は、アクチン免疫蛍光染色と画像解析によって定量することができる。細胞を4％（w / v）のパラホルムアルデヒド溶液で固定0.05パーセントv / vのTween-20を洗浄緩衝液でリンスし、0.1％（v / v）のTriton X-100溶液を浸透されています。 1％w / vのウシ血清アルブミン溶液でブロッキングした後、細胞を、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）結合ファロイジンでインキュベートする。細胞の免疫蛍光画像は、蛍光灯を使用して得たものです顕微鏡と加圧と制御細胞に対する神経突起の長さはImageJのソフトウェア（NIH）を用いて定量化されています。
4. 神経突起は軸索や樹状突起として識別することができます。軸索や樹状突起の形態学的変化を評価するために、実験は上述の各構造を検出する抗体を用いて繰り返すことができ、すなわち、樹状突起のための軸索と微小管結合タンパク質（MAP2）抗体のニューロフィラメント（NF）の抗体。
5. 微小管は神経細胞の主要な細胞骨格成分の一つであり、微小管への損傷は神経損傷のマーカーとして使用されてきました^。2微小管は、β-チューブリン抗体を用いた免疫蛍光可視化することができる。細胞は、後加圧の0〜24時間後に固定されたβ-チューブリン抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察しています。
6. 神経細胞とアポトーシス遺伝子発現に対する衝動的な加圧の効果を評価するために、全RNAは加圧され、コントロール細胞から抽出されます。ジェン電子式は、私たちのパブリッシュしたプロトコルと同様の定量的RT-PCRまたはリアルタイムRT-PCRを行うことにより調べることができます^。3

5。代表的な結果：

図1：圧力プロファイルの例としては、加圧室内のセルに適用される。 Kolskyバー装置は正常に約0.7ミリ秒の期間で2MPaのレベルは、単一パルス型衝動的な加圧を生成します。

図2：衝動的な加圧に神経細胞応答の例。 SH-SY5Y細胞は、チャンバコントロール細胞と比較して2メガパスカルショー異なる神経突起/軸索内訳を衝動的な加圧にさらされる。

6。困難とその解決策

1. チャンバーシールは克服すべき主要な障害の1つである。それはFOですOリング付きワイドディスクは暴利行為と増加摩擦の問題を持っていることウント。摩擦の影響を除去するだけでなく、ガウジング、テフロン配管工のテープでピストンテーピングの簡単な方法を防ぐために使用されます。これは、問題を解決し、所望の圧力レベルと継続時間を生成します。
2. 加圧された神経細胞の挙動、二次TBIのメカニズムや長期的な影響を評価する場合は特に、長いポストインキュベーション時間後に検討されるべきである。 Kolskyバーに移動させながら、細胞含有チャンバーは、加圧、および細胞培養フードに戻って移動する、潜在的にunsterile条件にさらされている。アセンブリ内の/分解細胞培養フード内側の細胞培養スライドとチャンバーのチャンバー部分と適切な動作のプリ殺菌により、長期的なポストインキュベーションは、最大数週間することが可能です。
3. データの再現性は、細胞の機械的刺激実験の重要なパラメータである。我々のデバイス、reproducibilit用神経細胞応答のyは、所望の衝動的な加圧プロファイルは、圧力レベルと期間の両方で、繰り返し取得する方法を決定します。我々は、各加圧のために得られた圧力分布を記録しているので、不要な圧力プロファイルから細胞応答データは、後で手動で除外することができます。
4. 分解チャンバアセンブリ、Kolskyバーに転送してマウントし、加圧、転送バック、チャンバを含む全体の加圧ステップは、未満、10分かかる。隣の細胞培養スライドが前圧の直後に加圧することができる。このように、加圧実験の十分な数を効率的に完了することができます。私たちのセットアップは直径18mmのカバーガラスを採用しています。一加圧実験は西側が（また、加圧された細胞の一部が死んでいるのが理由の一つです）基板サイズによるイムノブロッティングのために十分なタンパク質を提供していません。約3繰り返し加圧実験はimmunoblに必要なタンパク質の量を提供otting。繰り返しになりますが、再現性は圧力プロファイルとするたびにチェックされます。

Discussion

in vitroでの実験技術の多くは、TBIの条件で、脳細胞の損傷を研究するために試みられてきた。これらは、それは短期間の過圧がTBIのための支配的な物理的な要因であると仮定してきた^4,5流れ誘起せん断応力、体重低下、スタイラス裂傷、レーザー切断、砕石等、ストレッチニューロン/アストロサイトが含まれます。特に^6,7 、TBIの爆風の衝撃波は、ミリ秒オーダーのパルス持続時間を持っています^4は、この前提と観察に基づき、一時的な加圧が可能なバロメーター室をTBIの条件下で脳細胞の挙動を評価するために開発され、使用されています。例えば、流体パーカッション気圧外傷室0.5MPaで20〜30ミリ長く持続し、最大のピーク圧力との圧力パルスでTBIの下でヒトのグリア細胞の挙動を調べるために使用されていました^。6最近 、VandeVordら⁷使用される金属星状細胞を調べるためのボール打撃バロメーター室TBIのが、金属ボール打撃産複数の圧力パルスの下で行動。そこで本研究では、単一パルス型衝動的な加圧を生成する新規な細胞の加圧装置を開発しました。デバイスは、私たちの⁸と他の研究における材料試験装置として使われてきましたKolskyバーセットアップに基づいて開発されました。非常に高負荷率で^1,9 Kolskyバーの材料試験能力ができるように変更されました加圧室（図1）内の培養細胞への単一パルス型の過圧を適用します。我々は、正常に衝動的な過圧の大きさと持続時間を制御することができた。代表的な細胞応答として、我々は加圧されていないチャンバーコントロール細胞と比較して、2 MPaの圧力SH-SY5Y神経細胞で有意な神経突起と軸索消失を表示することが実証された。

結論として、我々は特別に設計されたKolskyを用いた新規な衝動的な細胞の加圧装置を開発バー装置とはTBI条件における神経細胞の応答の調査に、その潜在的な利用を実証しました。我々はまた、この技術は、細胞の任意のタイプは様々なレベルと期間で衝動的な圧力にさらされることができるという点で非常に汎用性があることに注意してください。したがって、デバイスは、細胞を傷つけるためだけでなく、積極的にその機能と運命決定において細胞を刺激するためだけではなく、衝動的な圧力誘起細胞のメカノトランスダクションの振る舞い​​を調査するために使用することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells
18 mm diameter glass coverslips
Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin
Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis
Kolsky bar impulsive pressurization device
Piston-cylinder cell pressurization chamber
Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston
Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar
General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.)