Summary
इस रिपोर्ट में व्यक्तिगत रूप से व्यवहार्य संलग्न presynaptic BOUTONS बनाए रखने न्यूरॉन्स की यांत्रिक अलगाव के लिए एक तकनीक को दर्शाता है. Vibrodissociated न्यूरॉन्स तेजी से उत्पादन, उत्कृष्ट औषधीय नियंत्रण और पड़ोसी कोशिकाओं से प्रभाव के बिना सुधार अंतरिक्ष दबाना फायदे हैं. इस विधि synaptic तत्वों और पैच दबाना रिकॉर्डिंग की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
यांत्रिक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से न्यूरॉन्स की हदबंदी लाभ है कि presynaptic BOUTONS ब्याज की अलग न्यूरॉन से जुड़ी रह गया है. शर्तों जहां कोशिकी और postsynaptic intracellular वातावरण को अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है के तहत synaptic प्रसारण की परीक्षा के लिए अनुमति देता है. Proteases के उपयोग के बिना एक तकनीक कंपन आधारित है, vibrodissociation के रूप में जाना जाता है, यांत्रिक अलगाव के लिए सबसे लोकप्रिय तकनीक है. एक छोटी सी गेंद के आकार आग पॉलिश टिप के साथ एक micropipette, एक मस्तिष्क एक P1-p21 कृंतक से बनाया टुकड़ा में रखा गया है. micropipette समानांतर टुकड़ा सतह स्फूर्त है और टुकड़ा मोटाई के माध्यम से पृथक न्यूरॉन्स की मुक्ति में जिसके परिणामस्वरूप कम. पृथक न्यूरॉन्स vibrodissociation के कुछ ही मिनटों के भीतर अध्ययन के लिए तैयार हैं. : इस तकनीक को प्राथमिक neuronal संस्कृतियों, मस्तिष्क स्लाइसें सहित और enzymatically पृथक न्यूरॉन्स के प्रयोग से अधिक लाभ है, बाह्य वातावरण के बेहतर पड़ोसी की कोशिकाओं के प्रभाव से मुक्त नियंत्रण; उपयुक्तता व्यवहार्य अपेक्षाकृत परिपक्व electrophysiological और इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त न्यूरॉन्स के तेजी से उत्पादन और सुधार पूरे सेल टुकड़ा या सेल संस्कृति की तैयारी में न्यूरॉन्स के सापेक्ष रिकॉर्डिंग में अंतरिक्ष दबाना, अच्छी तरह से नियंत्रित औषधीय तेजी से दवा आवेदन और कुल सेल superfusion का उपयोग प्रयोगों के लिए. यह तैयारी synaptic फिजियोलॉजी, औषध विज्ञान, मॉडुलन, और plasticity की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जीवित कोशिकाओं और BOUTONS में दोनों पूर्व और postsynaptic तत्वों की वास्तविक समय इमेजिंग भी संभव vibrodissociated न्यूरॉन्स का उपयोग. पूर्व और postsynaptic तत्वों की आणविक घटकों की विशेषता भी प्रतिरक्षाविज्ञानी और इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण के साथ प्राप्त किया जा सकता है.
Protocol
1. तैयारी ज्वाला सील ग्लास micropipette
- Microelectrode कांच का प्रयोग, एक ज्वलंत भूरी या समकक्ष micropipette डांड़ी (टिप व्यास ~ 2 सुक्ष्ममापी) पर एक मानक पैच दबाना micropipette खींच. प्लेस micropipette 200-300 सुक्ष्ममापी की एक व्यास के साथ जुड़े गेंद रूपों तक ~ 2 सेकंड के लिए एक Bunsen बर्नर से लौ में टिप.
- प्लेस लौ मोहरबंद है कि तेजी से पक्ष के लिए पक्ष स्फूर्त कर सकते हैं (यात्रा दूरी 100-200 सुक्ष्ममापी) एक piezoelectric bimorph, रिले, या equivalently प्रभावी उपकरण का उपयोग कर micromanipulator पर धारक पर पैच विंदुक.
2. P1-p21 चूहे या चूहे से मस्तिष्क स्लाइसें तैयारी
- 124 NaCl, 4.5 KCl, 1.2 2 नाह पीओ 4, 26 NaHCO 3, और 10 डी - ग्लूकोज: (मिमी में) निम्नलिखित संरचना के साथ कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF) तैयार करें . 95% ऑक्सीजन / ~ 15 मिनट के लिए 5% सीओ 2 गैस के साथ बुलबुला समाधान है, तो 2 मिमी CaCl 2 और 1 मिमी 2 MgCl जोड़ें .
- मस्तिष्क स्लाइसें काटना:
- Halothane या isoflurane साथ पशु anesthetize. जानवर सिर काटना - मस्तिष्क निकालना - वांछित अभिविन्यास (राज्याभिषेक, parasagittal, अनुप्रस्थ, आदि) में ब्लॉक मस्तिष्क के हित के क्षेत्रों को शामिल करने के लिए.
- प्रत्यय अवरुद्ध एक हिल मस्तिष्क aCSF में जलमग्न slicer की अवस्था में मस्तिष्क - 250-400 सुक्ष्ममापी मोटाई पर धारा मस्तिष्क - aCSF में जगह स्लाइस जाल पर "preincubation" चैम्बर कि द्रव / सभी सतहों पर गैस जोखिम के लिए अनुमति देता में carbogen साथ bubbled स्लाइस कम से कम एक घंटे के लिए इस माध्यम में संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
3. Vibrodissociation
- 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 2 MgCl, 2.5 2 CaCl, 10 पीएच के साथ डी - ग्लूकोज 7.4 करने के लिए सेट NaOH और उपयोग: एक HEPES बफर (मिमी) संरचना के नमकीन घोल के साथ 35 मिमी व्यास संस्कृति डिश भरें osmolarity ~ 300 sucrose का उपयोग mOsM करने के लिए समायोजित. संस्कृति व्यंजन निलंबन व्यंजन, मानक सेल संस्कृति बर्तन, ग्लास coverslip आवेषण के साथ संस्कृति व्यंजन या व्यंजन के साथ, उदाहरण के लिए, पाली एल Lysine लेपित मजबूत सेल पकवान नीचे का पालन करने के लिए की आवश्यकता पर निर्भर करता है हो सकता है.
- संस्कृति डिश में टुकड़ा प्लेस और 250 एक्स पर एक विदारक त्रिविमेक्ष के साथ कल्पना एक तुला प्लैटिनम (0.5 मिमी व्यास) तार टुकड़ा के ऊपर सतह पर रखा एक वजन के रूप में कार्य का उपयोग कर नीचे टुकड़ा पकड़ो.
- टुकड़ा की सतह पर वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में लौ सील micropipette की नोक स्थिति. Micromanipulator सक्रिय करने के लिए टिप laterally 10-30 हर्ट्ज पर भ्रमण ~ दूरी 100 सुक्ष्ममापी साथ कांपना,. Micromanipulator का प्रयोग, ऐसी है कि यह ~ 30 सेकंड के भीतर पूरे टुकड़ा के माध्यम से गुजरता टुकड़ा ऊतक में टिप ले जाने के गहरे. दोहराएँ इस कदम के रूप में पृथक दिया मस्तिष्क क्षेत्र से प्राप्य न्यूरॉन्स की संख्या को अधिकतम करने की जरूरत है.
- टुकड़ा से निकालें टिप - संदंश के साथ टुकड़ा ले और धीरे यह जबकि अभी भी समाधान में हिला - तो टुकड़ा पूरी तरह से हटाने और त्यागें.
- Dissociated कोशिकाओं को व्यवस्थित करने और कम से कम 10 मिनट के लिए पकवान नीचे का पालन करने की अनुमति दें.
4. Electrophysiological रिकॉर्डिंग
- एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर न्यूरॉन्स युक्त पकवान प्लेस और 10 x 63 x उद्देश्य के साथ कल्पना. एक चिकनी पेटेंट झिल्ली, blebbing नहीं, और एक detectable नहीं बल्कि oversized नाभिक के साथ न्यूरॉन्स के लिए देखो. यदि चरण विपरीत प्रकाशिकी का उपयोग किया जाता है, एक पीले रंग के साथ चरण उज्ज्वल न्यूरॉन्स के लिए देखो, नीले भी नहीं. कोशिकी वांछित लवण, पोषक तत्वों, रिसेप्टर antagonists युक्त समाधान के साथ Superfuse कोशिकाओं, आदि (हमारे मानक HEPES बफर उपर्युक्त खारा है (3.1 अनुभाग)), अक्सर 5 सुक्ष्ममापी 2,3-dioxo 6 नाइट्रो-1 के साथ पूरक, 2,3,4 - tetrahydrobenzo [च] quinoxaline-7-सल्फोनामाइड disodium (NBQX), और 25-100 सुक्ष्ममापी डी 2 एमिनो 5 phosphonopentanoic (AP5) एसिड ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स है कि तेजी से GABA के अलगाव के लिए अनुमति देता है ब्लॉक एक रिसेप्टर की मध्यस्थता 1,2 IPSCs.
- एक ज्वलंत भूरी या समकक्ष खींचने का उपयोग एक मानक पैच micropipette खींचो. पिपेट टिप प्रतिरोध MΩ 2-4 (लक्ष्य कक्ष आकार पर निर्भर करता है) जब एक सीएल से भरा होना चाहिए - आधारित समाधान.
- एक कल्पना मानक electrophysiological तकनीकों का उपयोग न्यूरॉन से एक रिकॉर्डिंग पूरे सेल स्थापित करना.
- सहज postsynaptic (sPSCs) धाराओं एक अंतराल मुक्त डेटा अधिग्रहण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए रिकॉर्ड. लागू 0.2-1 सुक्ष्ममापी tetrodotoxin और / या कम + 2 Ca - कोशिकी समाधान युक्त लघु postsynaptic धाराओं (mPSCs) रिकॉर्ड.
- समाधान और औषधीय एजेंटों सीधे कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है. हम समाधान की मुद्रा के साथ जुड़े वर्ग इत्तला दे दी ग्लास ट्यूब टयूबिंग की पार्श्व आंदोलन से जुड़े से स्थानीय superfusion का उपयोग एक stepper मोटर चालित micromanipulator पर मुहिम शुरू की. यह alloएमएस के 100s 10s में समाधान आदान - प्रदान के लिए था कोशिकी आणविक सामग्री में तेजी से परिवर्तन, रिसेप्टर agonists के आवेदन, आदि प्राप्त करने के
- Akaike और उनके सहयोगियों के लिए एकल presynaptic BOUTONS उत्तेजित 3,4 तकनीक विकसित की है . एक micropipette एक कल्पना bouton के पास रखा जाता है और उत्तेजना (5-10 μA के नकारात्मक उत्तेजना धाराओं, 0.1-0.2 एमएस अवधि) दिया जाता है. एकात्मक IPSCs दर्ज कर रहे हैं, और विफलताओं की विधि के रूप में इस तरह के तरीके presynaptic और postsynaptic समारोह में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. इमेजिंग presynaptic टर्मिनल
- Postsynaptic न्यूरॉन्स पैच विंदुक के माध्यम से विभिन्न रंगों से भरा जा सकता है. न्यूरॉन्स भी चयनित सेलुलर आबादी में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FPS) व्यक्त चूहों से बनाया जा सकता है है.
- Presynaptic टर्मिनल vibrodissociated चूहों कि विशेष interneuron आबादी में fps व्यक्त से बनाया न्यूरॉन्स पर visualized किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, ग्लूटामेट decarboxylase 65 (GAD65) प्रमोटर दिखाने हरे और hippocampal टोकरी कोशिकाओं और अन्य interneurons में somata प्रक्रियाओं द्वारा संचालित GFP व्यक्त चूहों. Hippocampal CA1 क्षेत्र से Vibrodissociated पिरामिड न्यूरॉन्स GFP पॉजिटिव अक्षतंतु टर्मिनलों उनके somata और प्रॉक्सिमल dendrites (चित्रा 1 ए) के लिए apposed है. चूहों से पिरामिड vibrodissociated कि व्यक्त synaptopHlourin (पीएच संवेदनशील GFP उत्परिवर्ती synaptic पुटिका जुड़े VAMP2 प्रोटीन के लिए जुड़े हुए) Thy1 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत भी FP-पॉजिटिव संलग्न BOUTONS कि पीएच संवेदनशील प्रतिदीप्ति (चित्रा 1 बी) दिखाने के न्यूरॉन्स.
- Presynaptic BOUTONS कैल्शियम सूचक रंजक और अन्य फ्लोरोसेंट अणु AM-esterified 5 यौगिकों का उपयोग कर के साथ लोड किया जा सकता है. चित्रा 2 कैल्शियम सूचक Fluo4-AM डाई का उपयोग कर लोड हो रहा है की एक उदाहरण दिखाता है. सबसे पहले, 1-2 सुक्ष्ममापी AM esterified डाई 10 मिनट के लिए 37 ° पर न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जाता है. डाई intracellular वातावरण, जहां फोड़ना अणु esterases में घुसना, मुक्त, सेल impermeant और unquenched डाई उपज कर सकते हैं. इस दृष्टिकोण दोनों पूर्व और postsynaptic सेलुलर तत्वों लोड करता है. लोड हो रहा है, कोशिकाओं के बाद HEPES buffered खारा समाधान के साथ धो रहे हैं और एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए 37 डिग्री पर रखा. पहले एक ग्लास विंदुक इलेक्ट्रोड के साथ एक GΩ सील करने के लिए, कोशिकाओं बाह्य बफर समाधान के साथ 3 बार rinsed हैं.
- एक पूरे सेल रिकॉर्डिंग तो एक डाई मुक्त intracellular समाधान का उपयोग कर स्थापित है. रिकॉर्डिंग के 2-5 मिनट के बाद, डाई ज्यादातर postsynaptic न्यूरॉन से निकाल दिया जाता है, Fluo-4-लोड synaptic BOUTONS के दृश्य की अनुमति. इस तकनीक सुनो एट अल 5 ने बीड़ा उठाया था.
- डाई लोड BOUTONS तो कल्पना या तो एक कैमरा आधारित या multiphoton खुर्दबीन के साथ एक उच्च वृद्धि, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का उपयोग कर सकते हैं. युगपत रिकॉर्डिंग पूरे सेल और कैल्शियम इमेजिंग एक के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है सेटअप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. न्यूरॉन और चित्रा 2C में दिखाया BOUTONS की छवियों को एक इलेक्ट्रॉन गुणा प्रभारी युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा के साथ कब्जा कर लिया गया. उत्तेजना के लिए प्रकाश स्रोत की शक्ति के साथ एक तटस्थ घनत्व 1.0 फिल्टर और एक परितारिका फिल्टर 12% के उत्पादन के लिए समायोजित 1.2% तनु किया गया था. हरी presynaptic BOUTONS से कैल्शियम यात्रियों और मनाया जा सकता है वास्तविक समय में दर्ज की, और ऑफ़लाइन मापा.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
सहज और वर्तमान इंजेक्शन पैदा Vibrodissociated न्यूरॉन्स की फायरिंग
एक ठेठ vibrodissociated hippocampal CA1 पिरामिड न्यूरॉन से रिकॉर्डिंग 4A चित्रा में दिखाए जाते हैं. स्वतःस्फूर्त overshooting कार्रवाई क्षमता पिरामिड चूहे basolateral प्रमस्तिष्कखंड, हिप्पोकैम्पस और 1,5 VTA से dissociated न्यूरॉन्स में मनाया जा सकता है. CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स से दौरान दबाना - वर्तमान रिकॉर्डिंग वर्तमान इंजेक्शन hyperpolarizing ठेठ वोल्टेज प्रतिक्रियाओं का उत्पादन, जबकि पर्याप्त परिमाण के depolarizing धाराओं ठेठ मध्यम मौजूदा स्तर और गैर मिलनसार कार्रवाई क्षमता के साथ मजबूत वर्तमान इंजेक्शन के लिए प्रतिक्रिया में देरी फायरिंग पैटर्न के साथ overshooting कार्रवाई क्षमता को प्रकाश में लाना ( 4B चित्रा).
उठना और लघु Vibrodissociated न्यूरॉन्स में GABAergic निरोधात्मक postsynaptic धाराओं
एक CSCL आधारित intracellular समाधान के साथ वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान, सहज synaptic धाराओं (चित्रा 5A) मनाया जाता है. इन घटनाओं को कम कैल्शियम युक्त 2,6 समाधान में समाप्त हो जाते हैं, और सबसे neuronal प्रकार में पूरी तरह से bicuculline या gabazine (चित्रा 5B, सी) के रूप में एक रिसेप्टर antagonists, यह दर्शाता है कि इन GABA रिलीज और सक्रियण द्वारा मध्यस्थता sIPSCs कर रहे हैं GABA द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं इस ionotropic रिसेप्टर उप प्रकार के. हालांकि, basolateral प्रमस्तिष्कखंड 2 और उदर tegmental क्षेत्र 5,7, GABA एक रिसेप्टर नाकाबंदी जैसे मस्तिष्क क्षेत्रों से प्रमुख न्यूरॉन्स मेंकम अवधि AMPA प्रकार रिसेप्टर्स की glutamatergic सक्रियण द्वारा मध्यस्थता EPSCs पता चलता है. दिलचस्प है, TTX की सांद्रता है कि सबसे विष के प्रति संवेदनशील वोल्टेज gated सोडियम चैनल की नाकाबंदी के लिए विशिष्ट हैं पर आवेदन आवृत्ति और कई मस्तिष्क (चित्रा 6A) क्षेत्रों 2,4,7 से vibrodissociated न्यूरॉन्स में मनाया sIPSCs के आयाम को कम कर देता है. इस प्रकार, सोडियम चैनल गतिविधि pinched बंद synaptic BOUTONS में GABA रिलीज में भाग लेता है. यह अभी तक नहीं है स्पष्ट है कि अगर पूर्ण विकसित सोडियम कार्रवाई क्षमता इन टर्मिनलों में पाए जाते हैं. यह ध्यान देने योग्य बात है कि एक अच्छी तरह से सील 1 सुक्ष्ममापी व्यास अक्षतंतु टर्मिनल के इनपुट प्रतिरोध GΩ रेंज में अच्छी तरह से होने की संभावना है लायक है. इस प्रकार, भी सोडियम चैनल की एक छोटी संख्या के उद्घाटन के टर्मिनलों बिगाड़ना कैल्शियम चैनलों कि उत्तेजना स्राव युग्मन मध्यस्थता को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. इन कैल्शियम चैनल के विषय में, सबूत से पता चलता है कि एन और पी / Q प्रकार चैनलों hippocampal CA1 और 8 कहीं से vibrodissociated तैयारी में GABAergic टर्मिनलों पर रिलीज में भाग लेने.
मॉडुलन और न्यूरोट्रांसमीटर और रिसेप्टर्स की संख्या से संचरण के plasticity vibrodissociated न्यूरॉन्स 3,4,9 का उपयोग करने के लिए जांच की गई. ऐसे modulatory कार्रवाई करने के लिए दिखाया न्यूरोट्रांसमीटर adenosine, GABA, serotonin, endocannabinoids, 2,6,10,11,12 आदि कर रहे हैं. इसके अलावा, अल्पकालिक जैसे endocannabinoid निर्भर निषेध (DSI) के विध्रुवण प्रेरित दमन synaptic plasticity, भी इस 2,11 तैयारी में वर्णित किया गया है . इन नतीजों से संकेत मिलता है कि रिसेप्टर की मध्यस्थता और अंतर्जात neuromodulators द्वारा पार synaptic संकेतन के कई रूपों vibrodissociated तैयारी में बरकरार हैं.
कैल्शियम और Vibrodissociated तैयारी में यात्रियों Axon टर्मिनल में vesicular रिलीज
EMCCD सुसज्जित उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग ऊपर का वर्णन करने के लिए, हम vibrodissociated न्यूरॉन bouton तैयारी में presynaptic टर्मिनलों में कैल्शियम यात्रियों की जांच की है. चित्रा 2 से पता चलता है एक hippocampal CA1 पिरामिड न्यूरॉन में हूँ esterified Fluo-4 और बाद में postsynaptic डाई कमजोर पड़ने के साथ सेल लोड हो रहा है. स्वतःस्फूर्त कैल्शियम यात्रियों कुछ डाई भरे हित के क्षेत्रों में चित्रा 6B (ROIs) के रूप में दिखाया गया BOUTONS में मनाया जाता है. 1 सुक्ष्ममापी tetrodotoxin (TTX) के आवेदन इन सहज यात्रियों समाप्त, यह दर्शाता है कि वे वोल्टेज gated सोडियम धाराओं कि अनायास BOUTONS में सक्रिय कर रहे हैं के सक्रियण द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं, बाद में कैल्शियम उगता करने के लिए अग्रणी. 10 मिमी से 40 मिमी के लिए तेजी से समाधान मुद्रा के साथ कोशिकी KCl बढ़ाने प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई उत्पादन के रूप में ROIs कि presynaptic टर्मिनल (चित्रा 7A) के अनुरूप में मापा. Postsynaptic न्यूरॉन से एक साथ रिकॉर्डिंग sIPSCs निगरानी और निर्धारित करती है कि घटना आवृत्ति उच्च + K विध्रुवण (चित्रा 7B) की वृद्धि हुई है के लिए प्रयोग किया जाता है.
में पुटिका संलयन presynaptic BOUTONS हम व्यक्त synaptopHlourin Thy1 प्रमोटर (लेबल spH21 चूहों) के नियंत्रण के तहत निर्माण चूहों का इस्तेमाल किया है कल्पना करने के लिए. SynaptopHluorin एक आणविक निर्माण में जो में क्रांतिवृत्त (बढ़ाया पीएच संवेदनशीलता के साथ एक GFP उत्परिवर्ती) pHlourin 12 पुटिका जुड़े झिल्ली प्रोटीन (VAMP2) 13 से जुड़ा हुआ है. यह व्यवस्था पुटिका लुमेन जहां अपेक्षाकृत अम्लीय वातावरण प्रतिदीप्ति quenches में pHlourin आकृति situates. पुटिका संलयन होने पर इस आकृति puncta में एक प्रतिदीप्ति में परिणामी वृद्धि कि vesicles / presynaptic टर्मिनलों के अनुरूप के साथ और अधिक तटस्थ बाह्य वातावरण से अवगत कराया है. SpH21 चूहों से hippocampal न्यूरॉन्स के Vibrodissociation आकार और स्थान GABAergic टर्मिनलों (चित्रा 8A) के लिए उम्मीद की फ्लोरोसेंट puncta के दृश्य के लिए अनुमति देता है. आवेदन उच्च कश्मीर + बाह्य समाधान युक्त इन टर्मिनलों में प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, और इस प्रभाव में जो कोशिकी कैल्शियम 0.2 मिमी (चित्रा 8B) से कम है एक बाहरी समाधान की उपस्थिति में अवरुद्ध है. इस प्रकार, प्रतिदीप्ति में विध्रुवण प्रेरित वृद्धि न्यूरॉन bouton तैयारी में GABAergic synapses पर उत्तेजना - स्राव युग्मन प्रतिबिंबित होता है.
presynaptic कैल्शियम यात्रियों और न्यूरॉन bouton तैयारी के अक्षतंतु टर्मिनलों में पुटिका संलयन उपाय करने की क्षमता हमें neuromodulators दुरुपयोग और presynaptic उत्तेजना स्राव युग्मन और exocytosis endocytosis / में शामिल तंत्र पर synaptic plasticity, दवाओं के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुमति देता है. इन तकनीकों में भी अन्य आणविक उपकरणों और अनुवांशिक इंजीनियर चूहों के साथ जोड़ा जा सकता है presynaptic समारोह मॉडुलन और / plasticity में विशेष रूप से प्रोटीन की भूमिका की जांच.
चित्रा 1 hippocampal CA1 क्षेत्र से Vibrodissociated न्यूरॉन्स (ए) डीआईसी के विलय छवि.एक GAD65 माउस से एन डी हरी प्रतिदीप्ति छवियों. डीआईसी छवि हरी टर्मिनलों के स्थानों के लिए स्पष्ट रूप से एक synaptophluorin माउस (spH21) (बी) प्रतिदीप्ति छवि दिखाने के लिए विलय कर दिया है. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी
चित्रा 2 कैल्शियम सूचक लोडिंग प्रक्रिया: (ए) पूरे सेल AM esterified डाई के साथ भरी हुई है, (बी) पूरे सेल रिकॉर्डिंग डाई dilutes, (सी) टर्मिनल हित के क्षेत्रों (arrowheads) के रूप में कल्पना कर रहे हैं.
चित्रा 3 एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग और vibrodissociated न्यूरॉन्स पर presynaptic टर्मिनलों में कैल्शियम इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक स्थापना के योजनाबद्ध आरेख. EMCCD = इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज डिवाइस युग्मित.
चित्रा 4 प्रतिनिधि waveforms दिखा (ए) एक vibrodissociated CA1 न्यूरॉन से सहज कार्रवाई क्षमता और (बी) झिल्ली वोल्टेज प्रतिक्रियाओं hyperpolarizing और एक CA1 न्यूरॉन से वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग में वर्तमान इंजेक्शन depolarizing.
चित्रा 5 (ए) एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन से सहज IPSCs के प्रतिनिधि waveforms. या bicuculline (20 सुक्ष्ममापी; सी), (ई.पू.) IPSCs या तो (बी 10 सुक्ष्ममापी) gabazine द्वारा अवरुद्ध किया गया.
चित्रा 6. TTX सहज GABAergic synaptic प्रसारण को रोकता है, और vibrodissociated hippocampal तैयारी में presynaptic कैल्शियम यात्रियों समाप्त. (ए) पहले एक vibrodissociated न्यूरॉन से और TTX आवेदन के दौरान रिकॉर्डिंग. आवृत्ति और sIPSCs के आयाम में कमी नोट. (बी) एक vibrodissociated न्यूरॉन पर एक Fluo-4-लोड presynaptic पहले टर्मिनल में और TTX आवेदन के दौरान कैल्शियम यात्रियों मनाया. यात्रियों की पूरी हानि नोट.
7 चित्रा साथ - साथ कैल्शियम सूचक इमेजिंग और sIPSC पूरे सेल रिकॉर्डिंग उच्च + K उत्तेजना के प्रभाव दिखा. (ए) प्रतिदीप्ति एक presynaptic Fluo - 04:00 डाई के साथ भरी हुई bouton से समय पर मापा. (ख) उच्च कश्मीर + अनुप्रयोग के दौरान sIPSC आवृत्ति और आयाम के साथ - साथ वृद्धि हुई है .
8 चित्रा Ca 2 + निर्भर उच्च कश्मीर spH21 hippocampal CA1 क्षेत्र से पिरामिड न्यूरॉन के presynaptic BOUTONS में प्रतिक्रिया. (ए) एक vibrodissociated न्यूरॉन के प्रतिदीप्ति छवि. (ख) उच्च कश्मीर + अनुप्रयोग (काली पट्टी द्वारा इंगित) हमारे सामान्य कोशिकी 2 Ca समाधान + युक्त (2 सीए 2 मिमी +) की उपस्थिति में एक प्रतिदीप्ति में निरंतर वृद्धि के परिणामस्वरूप. नहीं प्रतिदीप्ति वृद्धि कम कोशिकी Ca 2 + (0.2 मिमी 2 + Ca) में मनाया गया. ग्राफ में डाटा पूर्व उच्च कश्मीर + प्रतिदीप्ति स्तर सामान्यीकृत थे, और 3 BOUTONS से औसत प्रतिक्रिया दिखा.
Discussion
सफल vibrodissociation की आवश्यकता है कि स्लाइस स्वस्थ न्यूरॉन्स होते हैं और है कि बीचवाला रिक्त स्थान काफी लचीला न्यूरॉन्स विषाक्त क्षति के बिना टुकड़ा बाहर निकलने के लिए अनुमति. इस प्रकार, तकनीक जल्दी प्रसव के बाद उम्र (P1-21) पर बेहतर काम करता है जब स्वस्थ स्लाइस कम glial / interstiatial सामग्री से वयस्क मस्तिष्क स्लाइसें में पाया जाता है के साथ बनाया जा सकता है है. हमारे अनुभव में, तथापि, टुकड़ा टुकड़ा ही vibrodissociation तकनीक के लिए उल्टा हो सकता है में neuronal अस्तित्व के लिए तैयार करने के अनुकूलन. जबकि हम नियमित के लिए सीटू ठंड संशोधित aCSF जिसमें sucrose कोशिकी ना + और Ca 2 के ज्यादा के लिए प्रतिस्थापित किया गया है + vibrodissociation के लिए तैयार स्लाइस हमारे सामान्य रिकॉर्डिंग aCSF में हो (जैसे कटौती) तैयार कर सकते हैं का उपयोग करते हुए रिकॉर्डिंग में स्लाइस तैयार. जब खुद को स्लाइस में रिकॉर्डिंग के लिए स्लाइस व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से तैयारी हम भी 35 में सामान्य aCSF में स्लाइस ° सेक्शनिंग के बाद बस सी जगह है और उन्हें कमरे के तापमान के लिए लौटने से पहले उन्हें इस तापमान पर 30-60 मिनट के लिए छोड़. हालांकि, vibrodissociation के लिए तैयार स्लाइस तुरंत बस टुकड़ा करने की क्रिया के बाद कमरे के तापमान पर ले जाया जाता है. इन प्रक्रियाओं vibrodissociation के बाद स्वस्थ न्यूरॉन्स, शायद फर्म अंतरालीय ऊतक कि न्यूरॉन्स और अधिक आसानी से टुकड़ा से ही ढीला हिल की अनुमति देता है की कमी के कारण का एक उच्च उपज प्रदान करते हैं. हम exhaustively टुकड़ा तैयारी की स्थिति की जांच की है, जैसा कि हम नियमित रूप से किसी दिए गए दिन पर हमारी रिकॉर्डिंग और इमेजिंग प्रयोगों के लिए पर्याप्त न्यूरॉन्स प्राप्त है. यह संभव है कि टुकड़ा मोटाई या preincubaton प्रक्रियाओं में परिवर्तन के रूप में अतिरिक्त संशोधनों, स्वस्थ न्यूरॉन्स की उपज बढ़ाने के लिए बनाया जा सकता है है. एक सेल उपज बढ़ाने के लिए और बड़े पशुओं में काम करने के लिए तकनीक प्राप्त करने के प्रयास में बहुत हल्के protease उपचार की कोशिश की गई है. हालांकि, बेबदलता भी हल्के protease उपचार synapse कार्य को बाधित करने के लिए लगता है. इस प्रकार, जबकि protease और यांत्रिक हदबंदी अभी भी काम करने के लिए यह तिथि करने के लिए विश्वसनीय नहीं साबित कर दी है अग्रमस्तिष्क न्यूरॉन्स में पाया जा सकता है के संयोजन.
यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए स्वस्थ न्यूरॉन्स की अपेक्षाकृत कम उपज के बाद vibrodissociation मतलब है कि मुख्य रूप से प्रचुर मात्रा में neuronal उपप्रकारों, मुख्य रूप से प्रक्षेपण न्यूरॉन्स अध्ययन के लिए उपयोगी तकनीक है. उपलब्धता GFP-व्यक्त चूहों में छोटे neuronal subpopulations आसानी से पहचाना जा सकता है है इन दुर्लभ न्यूरॉन्स अध्ययन का मौका बढ़ जाती है. हालांकि, जब तक कि neuronal उपज में सुधार किया जा सकता है है काफी हद तक इन न्यूरॉन्स पर डेटा का संचय अपेक्षाकृत धीमी होने की संभावना है.
कई कदम करने के लिए कैल्शियम संवेदन रंगों के साथ न्यूरॉन्स के सफल लोड करने के लिए महत्वपूर्ण साबित किया है. AM-esterified डाई करने के लिए एक्सपोजर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया है, और हम डाई कम तापमान पर लोड करने की कोशिश कर में असफल रहा है. रंगों की एकाग्रता दोनों लोडिंग समय और तापमान पर विचार के बाद से यह प्रतीत होता है डाई लोडिंग की है कि उच्च एकाग्रता presynaptic BOUTONS में कैल्शियम एकाग्रता कम करती है अनुकूलित किया जाना चाहिए. हमने देखा है कि उच्च सांद्रता के साथ लोड sIPSCs के आयाम और आवृत्ति कम हो जाती है. जब लोड हो रहा है कैल्शियम संवेदन vibrodissociated न्यूरॉन्स के presynaptic टर्मिनलों में रंगों, देखभाल क्योंकि छोटे presynaptic BOUTONS की क्षमता बफरन सोम में से अलग हो सकता है लिया होना चाहिए और BOUTONS के आकार के अनुरूप नहीं हैं. न्यूरॉन युक्त व्यंजन HEPES बफर डाई लोडिंग निम्नलिखित बाहरी समाधान के साथ धो रहे हैं, और धोने के बाद वसूली समय महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए एक अच्छा मुहर बनाने, कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोया होना चाहिए गैर बाहरी सेलुलर झिल्ली से भली भाँति डाई अणु से छुटकारा पाने के.
इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और जीना सेल इमेजिंग के लिए vibrodissociated न्यूरॉन्स का उपयोग करने के अलावा, immunocytochemical तकनीक भी इन 11,12 कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है. कोशिकाओं को आसानी से और तय कर सकते हैं एंटीबॉडी की एक किस्म है, और अन्य सेल मार्कर के साथ दाग. इन कोशिकाओं का उपयोग GABAergic presynaptic टर्मिनलों में प्रोटीन अभिव्यक्ति के दृश्य के लिए एक साफ तैयारी प्रदान करता है. चूहों कि GABAergic न्यूरॉन्स के लिए विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त का प्रयोग अन्वेषक vibrodissociated तैयारी में व्यक्तिगत synaptic टर्मिनलों (चित्रा 1) की पहचान करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार की इमेजिंग फ्लोरोसेंट मार्करों लेजर आधारित माइक्रोस्कोपी और STED तरह नए (उत्तेजना उत्सर्जन रिक्तीकरण माइक्रोस्कोपी) तकनीक का उपयोग टर्मिनलों में रूपात्मक माप के लिए अनुमति दे सकता है. रंजक है कि synaptic पुटिका साइकिल चालन की रिपोर्ट के साथ विज़ुअलाइज़ेशन भी इस तैयारी के साथ संभव है. Akaike और सहकर्मियों styryl डाई, FM1-43 के साथ GABAergic टर्मिनलों लेबल रहने वाले 4 कोशिकाओं में टर्मिनलों कल्पना .
यह भी संभव हो vibrodissociated में प्रोफ़ाइल आरएनए अभिव्यक्ति के लिए एकल कोशिका रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर प्रदर्शन करना चाहिएन्यूरॉन्स. इस तकनीक नियमित enzymatically dissociated न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स सेल संस्कृति में विकसित करने के लिए लागू किया जाता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम डीआरएस स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. पिंग जून झू और Susumu Koyama तकनीक के प्रारंभिक के दौरान उनकी सहायता के लिए सेट है, और लिखित पांडुलिपि स्वरूपण में सहायता के लिए डॉ. वेरोनिका Alvarez. इस अध्ययन NIAAA के अंदर का नैदानिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान के प्रभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Cell Culture Dish (35 mm) | BD Biosciences | 353001 | |
| Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
| Piez–lectric Manipulator | EXFO | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
| SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piez–lectric manipulator |
| Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
| Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
| Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
| Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon Instruments | TS200 Diaphot | |
| EMCCD Camera | Andor | iXonEM+ DU-888 | |
| Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO | X-Cite 120PC | |
| Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes, Life Technologies | F14201 |
References
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