Summary
이 보고서는 첨부 presynaptic 부튼스을 유지 가능한 개별 뉴런의 기계적 분리를위한 기술을 보여줍니다. Vibrodissociated 뉴런은 빠른 생산, 뛰어난 약리 제어 및 인접 세포의 영향없이 향상된 공간 클램프의 장점이 있습니다. 이 방법은 시냅스 요소 및 패치 - 클램프 녹화 영상에 사용될 수 있습니다.
Abstract
중추 신경계에서 뉴런의 기계적 분리는 presynaptic 부튼스 관심의 절연 신경 세포에 연결된 유지되는 장점이 있습니다. 이것은 세포와 세포 postsynaptic 환경을 잘 제어할 수 조건에서 시냅스 전달의 시험을 수 있습니다. vibrodissociation로 알려진 프로 테아제를 사용하지 않고 진동 기반 기술, 기계 절연을위한 가장 인기있는 기법입니다. 작은 공 모양으로 불을 광택 팁과 micropipette은, P1 - P21 설치류에서 만든 뇌 슬라이스에 배치됩니다. micropipette은 슬라이스 표면에 평행하게 진동하고 고립된 뉴런의 해방에서 발생하는 슬라이스의 두께를 통해 저하됩니다. 고립된 뉴런은 vibrodissociation 몇 분 이내에 학습을위한 준비가되어 있습니다. ; 세포외 환경의 뛰어난 관리 인접 세포의 영향에서 무료로, 적합성 electrophysiological 및 이미징 연구에 적합 가능한 상대적으로 성숙한 뉴런의 빠른 생산이 기술을 포함하여 기본의 연결을 문화, 뇌 조각과 효소 고립된 뉴런의 사용을 통해 이점을 가지고 향상된 슬라이스 또는 세포 배양 준비에서 뉴런에 상대적으로 전체 셀 녹음 공간 - 클램프, 신속한 약물 응용 프로그램과 전체 세포 superfusion를 사용하여 잘 제어 약리 실험. 이 준비는 시냅스 생리학, 약리학, 변조 및 소성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 살아있는 세포와 부튼스에 모두 사전과 postsynaptic 요소의 실시간 영상은 vibrodissociated 뉴런을 사용하는 것도 가능합니다. 사전 및 postsynaptic 요소의 분자 성분의 특성은 또한 면역 및 이미징 기반의 접근 방식과 함께 얻을 수 있습니다.
Protocol
1. 준비 플레임 - 실드 유리 Micropipette
- microelectrode 유리를 사용하여, 플라밍 - 브라운 또는 동급 micropipette 풀러 (팁 직경 ~ 2 μm의)에 표준 패치 - 클램프 micropipette를 가져옵니다. 플레이스 micropipette는 200-300 μm의의 직경이 융합된 형태 볼 때까지 ~ 2 초의 알콜 램프의 불꽃에 팁.
- 빠르게 압전 bimorph, 릴레이, 또는 equivalently 효과 장치를 사용 (여행 거리 100-200 μm의) 사이드 - 투 - 측면을 진동 수있는 micromanipulator에 소유자에 장소 불꽃 - 봉인 패치 피펫.
2. P1 - P21 쥐 또는 마우스의 뇌 조각 준비
- 124 NaCl, 4.5 KCl, 1.2 아니 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 10 D - 글루코오스 다음 구성 (MM)와 인공 뇌척수 (aCSF)를 준비합니다. ~ 15 분 95 % 산소 / 5 % CO 2 가스 버블 솔루션은 다음 두 MM CaCl 2 및 1 ㎜ MgCl 2를 추가합니다.
- 뇌 조각 커팅 :
- 할로탄 또는 isoflurane과 동물을 마취. 동물 목을 벨 - 두뇌를 제거 - 원하는 방향 (등, 코로나, parasagittal, 가로)에 블록 두뇌의 관심 영역을 포함합니다.
- 부착은 aCSF에 빠져들 진동 뇌 기계의 단계에 차단 두뇌 - 250-400 μm의 두께로 섹션 두뇌 - aCSF에 적절한 조각은 유체 / 모든 표면에 가스 노출을 허용 그물에 "preincubation"챔버에 carbogen 함께 부풀어 오른 - 조각 하나 이상의 시간이 매체 평형 수 있습니다.
3. Vibrodissociation
- 과 NaOH를 사용하여 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl 2, 2.5 CaCl 2, 10 7.4로 설정 산도와 D - 글루코오스 다음 구성 (㎜)의 HEPES - 버퍼 생리 식염수와 35mm 직경 문화 요리를 채우기 osmolarity은 자당을 사용하여 ~ 300 mOsM 조정. 문화 요리 서스펜션 요리, 표준 세포 배양 접시, 유리 coverslip 삽입과 문화 요리,이나 접시 바닥에 강한 세포 준수의 필요성에 따라, 예를 들어, 폴리 - L - 라이신과 코팅 요리 수 있습니다.
- 문화 요리에 슬라이스를 삽입 250 X.에서 해부 입체경과 시각화 무게 역할을 슬라이스의 상단 표면에 위치 벤트 백금 와이어를 (0.5 mm 직경)를 사용하여 아래에 슬라이스를 잡아.
- 원하는 두뇌 지역에서 슬라이스 표면에 불꽃 - 봉인 micropipette의 팁을 위치. 여행 거리 ~ 100 μm의와 함께, 10-30 Hz에서에서 옆으로 팁을 진동하는 micromanipulator을 활성화합니다. micromanipulator 사용하여 그것이 ~ 30 초 이내에 전체 슬라이스 통과 이러한 슬라이스 조직으로 깊은 팁을 이동합니다. 특정 뇌 영역에서 얻을 수 고립된 뉴런의 개수를 최대화하기 위해 필요에 따라이 단계를 반복합니다.
- 슬라이스의 팁을 제거 - 집게로 슬라이스를 선택하고 부드럽게 아직 솔루션에있는 동안 그것을 흔들어 - 다음 완전히 슬라이스를 제거하고 폐기.
- dissociated 세포가 적어도 10 분 접시 아래로 정착하고 준수하도록 허용합니다.
4. Electrophysiological 녹음
- 거꾸로 현미경의 무대에서 뉴런을 포함하고있는 접시를 놓고 10 X 63 X의 목적으로 시각화. 부드러운 특허 막, 아니 blebbing 및 감지하지만 대형하지 핵로 신경을 찾습니다. 위상 콘트라스트 광학을 사용하는 경우도 파란색, 노란 - 가미와 위상 밝은 뉴런을 찾습니다. 원하는 소금, 영양분, 수용체 antagonists를 포함하는 세포 솔루션 Superfuse 세포 등 (우리의 표준 위에서 언급한 HEPES 버퍼 생리입니다 (섹션 3.1)), 종종 5 μm의 2,3 - dioxo - 6 - 니트로 - 1과 보충 빠른 GABA의 절연을 허용 ionotropic의 글루 탐 산염 수용체를 차단하는 2,3,4 - tetrahydrobenzo [F] quinoxaline - 7 - sulfonamide 나트륨 (NBQX), 그리고 25-100 μm의 D - 2 - 아미노 -5 - phosphonopentanoic 초산 (AP5) 수용체 - 중재의 IPSCs 1,2.
- 플라밍 - 브라운 또는 동급 풀러를 사용하여 표준 패치 micropipette을 당기세요. Club 호텔 가득 때 피펫 팁 저항 MΩ 2-4 (대상 셀 크기에 따라)해야합니다 - - 기반 솔루션입니다.
- 표준 electrophysiological 기법을 사용하여 시각 신경에서 전체 셀 녹음을 설정합니다.
- 갑 - 무료 데이터 수집 프로토콜을 사용하여 자연 postsynaptic 전류 (sPSCs)을 기록합니다. 0.2-1 μm의의 테트로도톡신 및 / 또는 낮은 칼슘 2 +를 적용 - 소형 postsynaptic 전류 (mPSCs)를 기록하는 세포외 솔루션을 포함.
- 솔루션 및 약리 대리인 직접 전지에 적용할 수 있습니다. 우리는 스테퍼 모터 구동 micromanipulator에 장착된 튜브의 측면 움직임을 포함하는 솔루션 교환 융합 평방 밀고 유리 튜브에서 지역 superfusion을 사용합니다. 이 allo세포외 분자 콘텐츠 급속한 변화, 수용체 agonists의 응용 등을 달성하기 위해 MS의 100s에 10 초에 솔루션을 교환했습니다
- 아카 이케와 동료들은 단일 presynaptic 부튼스에게 3,4을 자극하는 기술을 개발했습니다. micropipette는 시각 부통 근처에 위치하고 있으며 자극이 (5-10 μA의 부정적인 자극 전류, 0.1-0.2 MS 기간)이 주어집니다. 하나의 IPSCs는 기록하고 있으며, 이러한 실패의 방법으로 방법은 presynaptic과 postsynaptic 기능의 변화를 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
5. 이미징 Presynaptic 터미널
- Postsynaptic 뉴런은 패치 피펫을 통해 다양한 염료로 가득 수 있습니다. 뉴런은 또한 선택 세포 인구의 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형광 단백질 (FPS) 표현 생쥐에서 할 수 있습니다.
- Presynaptic 터미널은 특정 interneuron의 인구의 프레임을 표현 마우스로 만든 vibrodissociated 뉴런에 시각하실 수 있습니다. 예를 들어, 글루 탐 산염 탈카복실화효소 65 (GAD65) hippocampal 바구니 세포와 다른 interneurons의 발기인 쇼 녹색 somata과 프로세스에 의해 주도 GFP를 표현 쥐. hippocampal CA1 지역의 피라미드 Vibrodissociated 뉴런들은 somata 및 근위 dendrites (그림 1A)에 apposed GFP 양성 축삭 터미널이 있습니다. 표현 synaptopHlourin이 (산도에 민감한 GFP 돌연변이 시냅스 소포 - 관련 VAMP2 단백질에 융합) Thy1 모터의 제어하에도 산도에 민감한 형광 (그림 1B)를 표시 FP 양성 첨부 부튼스있다는 생쥐에서 vibrodissociated 피라미드 뉴런.
- Presynaptic 부튼스는 AM - esterified 화합물 5를 사용하고 칼슘 지표 염료 및 기타 형광 분자로 로드할 수 있습니다. 그림 2는 칼슘 표시기 염료 Fluo4 - AM을 사용하여 로딩의 예제를 보여줍니다. 첫째, 1-2 μm의 오전 - esterified 염료는 10 분 37 °에서 뉴런에 적용됩니다. 염료 무료, 셀 impermeant 및 unquenched 염료를 항복, 클리브에게 분자를 esterases 세포내 환경에 침투할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 모두 사전과 postsynaptic 세포 요소를로드합니다. 로딩 후, 세포가 HEPES 버퍼 생리 식염수로 씻어하고 추가로 10 분에 대해 37 °에서 보관. 전에 유리 피펫 전극과 GΩ - 시일을 만들기 위해, 세포는 외부 버퍼 솔루션으로 3 번 씻어서 있습니다.
- 전체 셀 녹음 다음 염료 무료 세포 솔루션을 사용하여 설정됩니다. 녹음 후 2-5 분 후, 염료는 대부분 Fluo - 4 - 로드된 시냅스 부튼스의 시각화을 허용, postsynaptic 신경 세포에서 제거됩니다. 이 기법은 예 외 5 개척했다.
- 염료 로드된 부튼스 다음 중 카메라 기반 또는 multiphoton 현미경으로 높은 배율, 높은 수치 조리개 목표를 사용하여 시각하실 수 있습니다. 동시 전체 셀 녹음 및 칼슘 이미징은 그림 3에 표시된 설정을 사용하여 얻을 수 있습니다. 신경 세포와 그림 2C에 표시된 부튼스의 이미지는 전자 곱한 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라로 캡처했다. 여기에 대한 광원의 전원이 12 % 출력에 조정 중립적인 밀도 1.0 필터 및 홍채 필터와 1.2 %로 감쇠되었다. 녹색 presynaptic 부튼스에서 칼슘 과도가 준수하고 실시간으로 기록하고, 오프라인 측정할 수 있습니다.
6. 대표 결과 :
Vibrodissociated 뉴런의 자연 및 현재 사출 Evoked 발사
전형적인 vibrodissociated hippocampal CA1 피라미드 신경 세포의 녹음은 그림 4A에 표시됩니다. 자연 overshooting 액션 잠재력은 쥐 basolateral 편도, 해마 및 VTA 1.5에서 dissociated 피라미드 뉴런에서 볼 수 있습니다. 충분한 크기의 depolarizing 전류 강해지는 현재 주사에 대한 응답으로 적당한 전류 레벨이 아닌 수용 행동 잠재력과 함께 전형적인 지연 발사 패턴 overshooting 액션 잠재력을 이끌어내는 동안 현재 주사를 hyperpolarizing CA1 피라미드 뉴런에서 동안 전류 클램프 녹음 (일반 전압 응답을 생성 그림 4B).
Vibrodissociated 뉴런의 자연과 미니 GABAergic 억제 Postsynaptic 해류
CsCl 기반 세포 솔루션 전압 클램프 녹음 중에는 자발적인 시냅스 전류는 (그림 5A) 관찰하고 있습니다. 이러한 이벤트는 낮은 칼슘 함유 용액 2,6로 대체하고 있으며, 대부분의 연결 유형을 완전히 GABA 같은 bicuculline 또는 gabazine (그림 5B, C)와 같은 수용체 antagonists, 이건 GABA 릴리스 및 활성화에 의해 매개 sIPSCs하는 표시에 의해 차단됩니다 이 ionotropic 수용체 subtype니다. 그러나, basolateral 편도 2 복부 tegmental 지역 5,7, GABA 수용체의 봉쇄와 같은 두뇌 지역에서 교장 뉴런에AMPA 형 수용체의 활성화에 의해 매개 glutamatergic 단축 기간 EPSCs를 보여줍니다. 흥미롭게도, 가장 독소에 민감한 전압 - 게이 티드 나트륨 채널의 봉쇄에 대한 구체적인 농도에서 TTX의 응용 프로그램은 여러 뇌 영역 (그림 6A) 2,4,7에서 vibrodissociated 뉴런에서 관찰 sIPSCs의 주파수와 진폭을 줄일 수 있습니다. 따라서 나트륨 채널 활동 모근 - 오프 시냅스 부튼스에서 GABA 릴리스에 참여하고 있습니다. 본격 나트륨 행동 잠재력이 터미널에서 발생하는 경우 그것은 아직 명확하지 않습니다. 그것은 잘 밀폐된 1 μm의 직경의 축삭 터미널의 입력 저항이 잘 GΩ 범위에있을 가능성이 있다고 지적 가치가있다. 따라서 나트륨 채널도 소수의 개방하면 여기 분비 커플링을 중재 칼슘 채널을 활성화하기 위해 터미널을 depolarize 충분한 수 있습니다. 이런 칼슘 채널의 주제에, 증거가 N과 P / Q - 타입 채널 hippocampal CA1과 다른 8 vibrodissociated 준비에 GABAergic 터미널에서 릴리스에 참여하는 것이 좋습니다.
신경 전달 물질과 수용체의 숫자에 의해 변조 및 전송의 소성은 vibrodissociated 뉴런에게 3,4,9를 사용하여 검사하고 있습니다. 이러한 modulatory 동작을 가지고 표시된 신경 전달 물질은 아데노신, GABA, 세로토닌, endocannabinoids 등 2,6,10,11,12 있습니다. 또한, 이러한 억제 (DSI)의 endocannabinoid 종속적인 탈분극 유도 억제와 같은 단기 시냅스 소성은 또한이 준비 2,11에서 설명되었습니다. 이러한 결과는 내생 neuromodulators하여 수용체 - 중재 및 횡단 시냅스 신호의 여러 형태 vibrodissociated 준비에 그대로 것을 나타냅니다.
Vibrodissociated 준비 칼슘 과도 및 액슨 터미널에서 기공을 갖는 출시
EMCCD 장착된 바뀌 현미경을 사용하면 위에서 설명, 우리는 vibrodissociated 신경 세포 - 부통 준비에 presynaptic 터미널에서 칼슘 과도를 조사했습니다. 그림 2는 hippocampal CA1 피라미드 신경 세포에 AM - esterified Fluo - 4 및 후속 postsynaptic 염료 희석과 셀 로딩을 보여줍니다. 자연 칼슘 과도 그림 6B에 대한 관심의 영역 (로아) 그림과 같이 몇 가지 염료 가득한 부튼스에서 관찰됩니다. 1 μm의의 테트로도톡신 (TTX)의 응용 프로그램들은 이후 칼슘 상승을 선도하는, 자발적 부튼스에서 활성화됩니다 전압 - 게이 티드 나트륨 전류의 활성화에 의해 매개되는 나타내는 이러한 자발적인 과도를 제거합니다. presynaptic 터미널 (그림 7A)에 해당하는 로아의 측정으로 빠른 솔루션 교류 40 MM 10 MM에서 세포외 KCl을 늘리면 형광 증가 생산하고 있습니다. postsynaptic 신경 세포의 동시 녹음 sIPSCs을 모니터링하고 이벤트 빈도가 높은 K + 탈분극 (그림 7B) 증가되었는지 확인하는 데 사용됩니다.
우리가 synaptopHlourin이 Thy1 발기인 (spH21 마우스로 표시)의 제어하에 구조 표현 쥐를 사용한 presynaptic 부튼스에 소포의 융합을 시각화합니다. SynaptopHluorin는 분자 구조에있는 황도 pHlourin (강화된 산도 감도와 GFP 돌연변이) 12은 소포 관련 멤브레인 단백질 (VAMP2) 13에 링크되어 있습니다. 이 배열은 비교적 산성 환경이 형광 꺼버리는 소포의 루멘에 pHlourin 모티브를 situates. 소포의 융합에 따라이 모티브는 vesicles / presynaptic 터미널에 해당하는 puncta에 형광의 결과 증가보다 중립 세포외 환경에 노출됩니다. spH21 생쥐에서 hippocampal 뉴런의 Vibrodissociation는 GABAergic 터미널 (그림 8A)의 예상 크기와 위치의 형광 puncta의 시각화를위한 수 있습니다. 의 응용 높은 K + - 외부 솔루션을 포함하는 것은 이러한 단말기에 형광 증가하고,이 효과는 세포외 칼슘이 0.2 MM (그림 8B)로 감소되는 외부 솔루션의 면전에서 차단됩니다. 따라서, 형광의 탈분극 유도 증가는 신경 세포 - 부통 준비 GABAergic 시냅스에서 분비 여기 - 커플링을 반영하기 위해 나타납니다.
presynaptic 칼슘 과도하고 신경 세포 - 부통 준비의 축삭 터미널에서 소포의 융합을 측정하는 기능은 우리가 학대하고 여기 - 분비 커플링 및 exocytosis / endocytosis에 관여 presynaptic 메커니즘에 시냅스 소성의 neuromodulators, 약물의 효과를 조사 수 있습니다. 이러한 기술은 또한 presynaptic 기능 및 변조 / 소성에서 특정 단백질의 역할을 검토하는 다른 분자 도구와 유전 - 공학 마우스와 함께하실 수 있습니다.
그림 1. hippocampal CA1 지역에서 Vibrodissociated 뉴런 DIC의 (A) 합병 이미지GAD65 마우스 차 녹색 형광 이미지. DIC 이미지가 명확하게 (B) 형광 이미지 synaptophluorin (spH21) 마우스에서 녹색 단말기의 위치를 표시 병합됩니다. 스케일 바 = 10 μm의
그림 2 칼슘 지표 로딩 절차 : (A) 전체 세포가 AM - esterified 색소를 읽어, (B) 전체 셀 녹음 염료 dilutes, (C) 터미널 관심 지역 (화살촉)로 시각입니다..
그림 3. vibrodissociated 뉴런의 presynaptic 터미널에서 동시 전체 세포 기록과 칼슘 이미징을위한 실험 설정의 도식 다이어그램. EMCCD = 전자 곱한 요금은 장치를 결합.
그림 4. 대표 파형을 보여주는 (A) 자발적인 실천 vibrodissociated CA1 신경 세포의 잠재력 및 (B) 막 전압 응답 hyperpolarizing 및 CA1의 신경 세포에서 전류 클램프 녹음에서 현재 주사를 depolarizing 수 있습니다.
그림 5. CA1 피라미드 신경 세포의 자발적인 IPSCs의 (A) 대표 파형. 또는 bicuculline (20 μm의, C), (BC) IPSCs는 gabazine (B 10 μm의)에 의해 차단되었습니다.
그림 6. TTX는 자연 GABAergic 시냅스 전달을 억제하고, vibrodissociated hippocampal 준비 presynaptic 칼슘 과도를 제거합니다. 전에 vibrodissociated 신경 세포로부터 TTX 응용 프로그램 중 (A) 레코딩. 빈도 감소와 sIPSCs의 진폭을 확인합니다. (B) 칼슘 과도 전에 vibrodissociated 신경 세포에 Fluo - 4 - 로드된 presynaptic 터미널에서 TTX 응용 프로그램을하는 동안 관찰했다. 과도의 전체 손실을합니다.
그림 7. 동시 칼슘 지표 이미징과 높은 K + 자극의 효과를 보여주는 sIPSC 전체 셀 녹음. (A) 형광이 Fluo - 오전 4시의 염료와 함께 로드된 presynaptic 부통에서 시간이 지남에 따라 측정. 높은 K + 응용 프로그램 중 sIPSC 주파수와 진폭의 (B) 동시 향상시킬 수 있습니다.
그림 8. 칼슘 2 +에 의존 높은 K + 응답 hippocampal CA1 지역의 피라미드 신경 세포의 spH21 presynaptic 부튼스 인치 vibrodissociated 신경 세포의 (A) 형광 이미지. (B) 하이 K +는 응용 프로그램 (검정색 막대로 표시)의 정상적인 세포 칼슘 2 + 함유 용액 (2 MM Ca2 +)의 면전에서 형광의 지속적인 증가 결과. 아무 형광 증가 낮은 세포외 칼슘 2 + (0.2 MM 칼슘 2 +)에서 관찰되지 않았습니다. 그래프에서 데이터는 사전에 높은 K + 형광 수준으로 정상화, 3 부튼스에서 평균 응답을 표시했다.
Discussion
성공 vibrodissociation는 조각 건강한 뉴런을 포함하고 중간 공백 신경 독성 손상없이 슬라이스를 종료하도록 충분히 유연해야합니다. 건강 조각이 성인 뇌 조각에서 발견보다 glial / interstiatial 재료로 만든 수있을 때 따라서, 기술은 초기 출생 후의 나이 (P1 - 21)에서 최적의 작동합니다. 우리의 경험에서는, 그러나, 자체 vibrodissociation 기술에 대한 역효과 수있는 통에의 연결을 생존을위한 슬라이스 준비를 최적화. 우리는 일상적으로 자당이 vibrodissociation 준비 + 조각이 우리의 일반적인 레코딩 aCSF에서 (예 : 절단) 준비를 수있는 세포 나 + 및 CA 2 정도에 대한 대체되어있는 차가운 수정 aCSF를 사용하여 현장 기록에 대한 조각 준비 반면. 조각 자체의 개별 뉴런에서 녹음 조각을 비교할 때 우리는 또한 ° C 단지 sectioning 후 35 정상 aCSF의 조각을 배치하고 실내 온도로 돌아가기 전에이 온도에서 30-60 분을 두십시오. 그러나, vibrodissociation 준비 조각 그냥 깔끔히 후 상온 즉시 이동됩니다. 이러한 절차는 뉴런이 더 쉽게 슬라이스 자체에서 느슨한 떨면서 수 있습니다 회사 중간 조직의 부족으로 인해 아마도 vibrodissociation 후 건강한 뉴런의 높은 수율을 제공합니다. 우리가 일상적으로 하루에 대한 기록 및 이미징 실험에 충분한 신경을 얻기로 우리는 철저하게, 슬라이스 준비 조건을 검사하지 않았습니다. 이러한 슬라이스 두께 또는 preincubaton 절차의 변경과 같은 추가적인 수정이, 건강한 뉴런의 수율을 높이기 위해 만들 수 있다고 수도 있습니다. 매우 가벼운 테아제 치료는 세포 수율을 향상시키고 기존의 동물에서 작업하는 기술을하기 위해 노력하고 있습니다. 그러나, 결국에 더 약한 테아제 치료 버렸네 기능을 방해하는 것 같습니다. 따라서, 동시에 프로 테아제 및 기계적 분리는 여전히 최신 forebrain의 뉴런에서 신뢰성이 입증되지 않은 작업 찾을 수의 조합.
vibrodissociation이 기술이 풍부한 subtypes의 연결을 주로 프로젝션 뉴런을 공부 주로 유용있다는 것을 의미합니다 이후 이것은 건강한 뉴런의 상대적으로 낮은 수확량에도 주목한다. 의 가용성 GFP - 표현 소형의 연결 subpopulations 쉽게 확인할 수있는 생쥐 것은 이러한 rarer의 뉴런을 공부의 기회를 증가시킵니다. 의 연결 수율을 향상시킬 수 없으면 그러나, 실질적으로 이러한 뉴런의 데이터 축적은 상대적으로 느린 될 가능성이 높습니다.
몇몇 단계는 칼슘 감지 염료와 뉴런의 성공 로딩에 중요한 것으로 입증했습니다. AM - esterified 염색에 노출이 37 ° C에서 수행하고, 우리는 낮은 온도에서 염료로드하려고에 실패했습니다. 염료의 농도는 염료 로딩의 높은 농도가 presynaptic 부튼스의 칼슘 농도를 감소 나타나는 때문에 로딩 시간과 온도 모두를 고려하여 최적화되어야합니다. 우리는 높은 농도로 로딩하면 빈도와 sIPSCs의 진폭을 감소 것을 관찰했습니다. 로드할 때 칼슘을 감지 vibrodissociated 뉴런의 presynaptic 터미널에 염료를주의 작은 presynaptic 부튼스의 용량을 버퍼링하는 것은 소마에서 다를 수 있기 때문에 촬영 및 부튼스의 크기가 일치하지해야합니다. 신경 세포 함유 요리는 염료로드 다음 HEPES 버퍼 외부 솔루션과 함께 세탁하고, 세탁 후 회복 시간이 매우 중요합니다입니다. 또한, 전체 세포 기록을위한 좋은 도장을 만들어, 세포는 외부 세포 멤브레인 이외의 internalized 염료 분자 없애 깨끗이 씻어해야합니다.
전기 생리학 및 라이브 셀 이미징에 대한 vibrodissociated 뉴런을 사용하는 것 외에도, immunocytochemical 기술은 이러한 세포 11,12에도 적용할 수 있습니다. 전지는 쉽게 고정 및 항체의 다양한, 그리고 다른 세포 마커 물들일 수 있습니다. 이러한 세포의 사용은 GABAergic presynaptic 터미널에서 단백질 표현의 시각화를위한 깨끗한 준비를 제공합니다. GABAergic 뉴런 특정 발기인의 통제하에 형광 단백질을 표현하는 마우스를 사용하면 조사가 vibrodissociated 준비의 개별 시냅스 터미널 (그림 1)을 식별할 수 있습니다. 이 유형의 이미징 형광 표식이 레이저 기반의 현미경과 같은 최신 기술 STED (자극 방출 고갈 현미경)을 사용하여 터미널에서 형태학의 측정에 허용할 수 있습니다. 시냅스 소포의 자전거를보고 염료와 시각화이 준비도 가능합니다. 아카 이케와 동료는 살아있는 세포 4 터미널을 시각화하기 위해 styryl 염료, FM1 - 43와 GABAergic 터미널을 분류했습니다.
또한 vibrodissociated의 프로필 RNA 표현에 단일 셀 리버스 transcriptase PCR을 수행할 수 있어야한다뉴런. 이 기술은 정기적으로 세포 배양 재배 효소 - dissociated 뉴런과 뉴런에 적용됩니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 DRS을 인정하고 싶습니다. 초기 중에 도움 핑 Jun Zhu와 스스무 고야마은 기술의 설정 및 서면 논문 서식에 도움 박사 베로니카 알바 레즈. 이 연구는 NIAAA의 교내 임상 및 바이오 메디컬 연구의 부문으로 자금을했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Cell Culture Dish (35 mm) | BD Biosciences | 353001 | |
| Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
| Piez–lectric Manipulator | EXFO | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
| SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piez–lectric manipulator |
| Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
| Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
| Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
| Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon Instruments | TS200 Diaphot | |
| EMCCD Camera | Andor | iXonEM+ DU-888 | |
| Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO | X-Cite 120PC | |
| Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes, Life Technologies | F14201 |
References
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala. J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala. J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).
- Akaike, N., Moorhouse, A. J. Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology. Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).
- Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron. Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).
- Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area. J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).
- Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons. J Physiol. 529, 373-383 (2000).
- Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area. Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).
- Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons. Brain Res. 951, 121-129 (2002).
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity. J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).
- Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation. Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).
