Summary
获得原代培养大鼠肝细胞的巨噬细胞的一个新的方法来描述。这种方法利用在文化的巨噬细胞增殖，选择性附件晃动培养瓶和塑料菜的净化。这项技术有效地提供肝巨噬细胞，而无需复杂的设备和技能。
Abstract
Kupffer细胞是肝脏特异性居民的巨噬细胞和1-3肝的生理和病理的功能发挥的重要作用。虽然肝巨噬细胞的分离方法有良好的描述4-6，大多数这些方法需要复杂的设备，如离心elutriator和技术技能。在这里，我们提供了一种新的方法来获得足够数量和纯度的示意图如图1所示，混合成年大鼠肝细胞的原代培养肝巨噬细胞。
两步灌注法7,8肝细胞分解后，大多是实质肝细胞组成的一小部分是准备和播种到T75组织的DMEM和10％FCS.Parenchymal的肝细胞组成的培养基的培养瓶中，失去上皮细胞的形态文化的几天内，退化或转化为成纤维样细胞（图2）。由于文化的收益，6天左右，相衬明亮，圆的巨噬细胞样细胞开始增殖的成纤维细胞表（图2）。巨噬细胞样细胞的增长继续达到12天左右的最高水平，覆盖烧瓶表面上的细胞片。晃动培养瓶，巨噬细胞的培养基中随时暂停。塑料菜在巨噬细胞选择性粘附的结果其后的转让和潜伏期短（图3），其他的污染细胞继续暂停。后，用PBS漂洗，附加的巨噬细胞的收获。可多次收获超过10 6细胞来自同一T75组织培养瓶中，在2至3天的间隔两周以上（图3）。孤立的巨噬细胞的纯度分别为95％至99％，流式细胞仪评估或分离的细胞免疫细胞化学大鼠巨噬细胞特异性抗体（图4）。显示后，用LPS刺激，并形成积极吞噬聚苯乙烯珠（图5），重组GM - CSF的增殖反应，炎症/抗炎细胞因子的分泌多核巨细胞9。
总之，我们提供了一种简单而有效的方法，以获得足够数量和纯度，无需复杂的设备和skills.This方法可能适用于其他哺乳动物的肝巨噬细胞。
Protocol
1。肝脏灌注
- 麻醉成年雄性大鼠（在10至15周，体重150-200克），通过腹腔注射戊巴比妥钠溶液（50毫克戊巴比妥钠/公斤体重）。
- 放置在不锈钢锅的动物和70％的乙醇喷洒在其腹部和胸部。
- 做一个小切断皮肤和剥离。打开一把剪刀切腹部。
- 确认门静脉的位置，通过门静脉和松散丛下一个手术线程。
- 丛下腔静脉和肠系膜上静脉，以防止血液回流到肝脏的远端部分。用剪刀切割膜片打开胸腔，暴露心脏。
- 进入门静脉插入塑料导管（直径为2毫米），并拧紧螺纹导管周围。
- 连接导管灌注系统，这是用洗涤液（钙 + 镁2 +含EGTA，0.5毫米10毫米的HEPES和碳酸氢钠 3 4.2毫米的免费的HBSS，pH值7.2）装在37预热° C。
- 开始原位灌注10毫升/分钟的速度。同时，削减在右心房壁。继续灌注10分钟。
- 切换到胶原酶溶液灌注液[含10MM的HEPES和4.2mm的碳酸氢钠 3型为辅的HBSS我胶原酶（0.05％）和胰蛋白酶抑制剂（50微克/毫升），pH值7.5，灌注速度为10 - 20分钟10毫升/分钟，直到肝脏稍肿，并显示为浆膜下的肝结构解体的标志。
2。脑实质丰富的肝细胞分数
- 取出，仔细转移到无菌的胶原酶溶液含有25毫升的烧杯中肝脏。剪刀切碎成小块。
- 添加到由此产生的细胞悬液75毫升冷的MEM。轻柔吹打后，滤液通过细胞过滤器（100微米），去除结缔组织和未消化的组织碎片。
- 在50 XG在4 ° C（刹车关闭）1分钟，转移到50 ml锥形管和离心滤液。
- 小心弃上清。冷的MEM重悬沉淀。
- 重复2.4）的三倍。
3。肝细胞混合小学文化
- 暂停的DMEM含10％热灭活的FCS，补充到100微米β-巯基乙醇，10微克/毫升的胰岛素，100微克/ ml链霉素和100 U / ml青霉素，和种子组成的培养基中的细胞获得的2.5）五至十年的组织培养瓶（表面积：75厘米2）密度6.7 × 10 4细胞/平方厘米 （5 × 10 6细胞/烧瓶/ 12日-15毫升中等）。
- 孵育文化flasksat 37 ° C在5％的CO 2的气氛- 95％的空气。
- 更换培养基中每2至3天的时间间隔。
4。巨噬细胞的选择性分离
- 经过12天的文化，巨噬细胞增殖的细胞片上。通过互惠这些细胞悬浮培养瓶中摇晃，在80 - 30分钟每分钟120招在37 ° C。
- 转移到100毫米的非组织文化品位塑料菜培养基。游泳池从两个T75烧瓶中期到一个塑料盘。笔芯培养瓶中生长中期和回报他们的孵化器。
- 塑料菜孵育30分钟，在37 ° C在5％的CO 2的气氛- 95％的空气。巨噬细胞容易附着到非组织的文化品位，根据这个孵化过程中的塑料菜，而其他污染的细胞不。
- 吸液轻轻冲洗，用PBS塑料盘。重复此步骤三次。
- 加入1毫升的TrypLE Express解决方案，入菜，孵育10min后在37 ° C在5％的CO 2的气氛- 95％的空气。
- 加入9毫升培养基中。所附的巨噬细胞由细胞刮刀轻轻刮去。
- 转移到一个15毫升的锥形管和离心机在180 5分钟在25 ° C（刹车）XG的细胞悬液。
- 弃上清，加入1毫升培养基中。大力吹打分离成单个细胞。枚举由血球计数细胞数量。
- 分离步骤，可重复，在2至3天的间隔相同的文化，两个多星期的烧瓶。
- 孤立的巨噬细胞可在3.1中描述的生长培养基中培养。
5。代表性的成果
混合成年大鼠肝细胞的原代培养的一个例子是如图2所示。实质肝细胞失去上皮细胞的形态，文化的几天内退化或转化为成纤维样细胞。然后，大约每天6至12，相位对比明亮，vigourouly一轮巨噬细胞样细胞增殖的成纤维细胞表。培养瓶中摇晃，巨噬细胞可随时暂停的培养基，并随后转移和孵化塑料菜的结果在巨噬细胞选择性粘附（图3）。早在8天可收获巨噬细胞样细胞，并数达到12至14天的最大水平。超过10 6细胞可以从T75培养瓶中多次收获在2至3天的间隔两周以上，使每个烧瓶中的细胞总数的10 7％T75培养瓶中（图3）产量。孤立的巨噬细胞的纯度分别为95％至99％，作为评估流式细胞仪或大鼠巨噬细胞特异性抗体的免疫细胞化学法，如ED - 1（图4），ED - 3，OX - 41（图4）和Iba1 9。分离出的细胞显示了积极吞噬聚苯乙烯珠（图5），增殖反应，以重组GM - CSF与LPS刺激后，9多核巨细胞形成炎症/抗炎细胞因子的分泌，如巨噬细胞的典型特征。
图1混合原代培养大鼠肝细胞巨噬细胞样细胞的选择性分离和净化计 划。
图2原代培养大鼠肝细胞和巨噬细胞样细胞增殖。箭头表示多核巨细胞。比例尺= 100微米。从免疫学方法的杂志，Vol.360，47-55（2010）与爱思唯尔的许可9重印。
图3。选择性分离巨噬细胞样细胞的震动和附件方法。细胞悬浮培养液中摇动烧瓶，随后转移到非组织培养级塑料菜，并在37℃孵育早在10 min后，电镀，连接盘表面，仍然暂停，而其他污染的成纤维细胞巨噬细胞样细胞。用PBS冲洗后，获得高度纯化的巨噬细胞的人口。这些细胞获得了典型的巨噬细胞的形态，经过40分钟的文化，并经常观察有丝分裂细胞（箭头）。回收的手机号码，随后从不同文化时期的烧瓶变化显示。值是一个平均± SD三至五个烧瓶。实验重复3次，数据是由不同的符号表示。比例尺= 100微米。从免疫学方法的杂志，Vol.360，47-55（2010）与爱思唯尔的许可9重印。
图4。单克隆抗体对大鼠巨噬细胞巨噬细胞样细胞的免疫细胞化学染色。
图5。吞噬FITC标记的巨噬细胞样细胞微球。
Discussion
在这里，我们报告一种简单而有效的方法来获取巨噬细胞的原代培养的成年大鼠肝细胞混合。我们的方法依赖小说中的巨噬细胞的增殖活性在大鼠肝细胞混合培养，那么随后的分离和纯化这些细胞作为巨噬细胞9的生物学特性的基础上。它可能会在成人肝细胞的原代培养的混合增殖的巨噬细胞可能起源库普弗或进入实质肝细胞的一小部分污染的相关细胞。巨噬细胞，有可能造成实质肝细胞的10和其他混合的原代培养的成纤维细胞转化的具体环境变化作出回应。
总之，我们的方法提供足够数量和纯度的大鼠肝cellswithout主要使用了先进的设备和技术技能的文化巨噬细胞样细胞的隔离。此外，分离过程中可重复相同的培养瓶中，两个多星期。这种方法可能适用于其他哺乳动物物种。
Disclosures
所有的动物都被保留，并在全国动物卫生研究所动物设施的经营，根据动物实验由该机构的委员会提出的指导方针和法规。
Acknowledgments
这项工作是由研究赠款和赠款援助农业，林业和日本渔业部的食品纳米技术项目。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
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