Summary
Denna video visar protokoll för DNA-extraktion från formalinfixerade paraffininbäddade material. Detta är en flerdagars förfarande där vävnadssnitt är avparaffinerade med xylen, uppblött med etanol och behandlas med proteinas K för att rena och isolera DNA för efterföljande genspecifika eller genom hela analysen.
Abstract
Sjukdomens utveckling och progression kännetecknas av frekventa genetiska och epigenetiska avvikelser inklusive kromosomala omdisponeringar, kopiera vinster nummer och förluster och DNA-metylering. Framsteg inom high-throughput, genomet hela profilering teknik, såsom mikroarrayer, har avsevärt förbättrat vår förmåga att identifiera och upptäcka dessa specifika förändringar. Men eftersom tekniken fortsätter att förbättras, är en begränsande faktor prov kvalitet och tillgänglighet. Vidare uppföljning klinisk information och sjukdom resultatet är ofta samlas år efter den första provtagning. Prover, är oftast formalinfixerade och paraffininbäddade (FFPE), lagras på sjukhus arkiv i många år decennier. DNA kan effektivt återhämtat sig från paraffininbäddade provexemplar om lämplig metod för utvinning tillämpas. Hög kvalitet DNA extraherat från bevaras på rätt sätt och förvaras prover kan stödja kvantitativa analyser för jämförelser mellan normala och sjuka vävnader och generering av genetiska och epigenetiska signaturer 1. För att extrahera DNA från paraffininbäddade prover kärnor vävnad eller microdissected vävnad utsätts för xylen behandling, som löser upp paraffin från vävnaden, och sedan uppblött med hjälp av en serie av etanol tvättar. Proteiner och skadliga enzymer som nukleaser därefter brytas ned av proteinas K. Tillsats av lyseringsbuffert, som innehåller denatureringsmedel som natriumdodecylsulfat (SDS), underlättar matsmältningen 2. Nukleinsyror renas från vävnaden lysat med buffert-mättade fenol och hög hastighet centrifugering som genererar en bifasisk lösning. DNA och RNA kvar i den övre vattenfasen, medan proteiner, lipider och polysackarider är bundet i mellan och organisk-faser respektive. Lagring av vattenfasen och upprepade fenol extraktioner genererar ett rent prov. Efter fenol extraktioner är RNas En tillsättas för att eliminera kontaminerande RNA. Ytterligare fenol extraktioner efter inkubation med RNas A används för att avlägsna alla återstående enzym. Tillägget av natriumacetat och isopropanol utfällningar DNA, och hög hastighet centrifugering används för att pellets DNA och underlätta isopropanol borttagning. Överskott salter som överförts från nederbörden kan störa efterföljande enzymatiska analyser, men kan tas bort från DNA genom tvättning med 70% etanol, följt av centrifugering att åter pellet DNA 3. DNA är resuspenderas i destillerat vatten eller buffert val, kvantifieras och förvaras vid -20 ° C. Renat DNA kan sedan användas i efterföljande program som inkluderar, men är inte begränsade till, PCR, array jämförande genomik hybridisering 4 (array CGH), T-DNA Immunoprecipitation (MeDIP) och sekvensering, vilket möjliggör en integrerad analys av vävnad / tumörprover.
Protocol
Discussion
Biopsier eller kirurgiskt exciderad vävnader för histopatologiska analys och diagnos är ofta formalin fasta och paraffininbäddade (FFPE) för långtidsförvaring. Med det växande intresset för att förstå den genetiska grunden för sjukdomen, representerar förmågan att extrahera DNA från dessa prover en ovärderlig källa till diagnostiskt material som kan användas för genomisk analys och translationell studier. Historiskt FFPE proven ansågs inte en livskraftig källa för molekylär analys som nukleinsyror kan vara kraftigt modifierad av protein-nukleinsyra och protein-protein cross länkning 6. Men gör upptäckten att proteas matsmältningen frigör fragmenterade nukleinsyror som är lämpliga för efterföljande analyser inklusive PCR, array CGH, sekvensering och metylering profilering användningen av dessa värdefulla prover för genetisk analys 6.
DNA-extraktion från paraffininbäddade vävnader är ett stabilt förfarande som bygger på differentiell löslighet att rena DNA. Extraherade DNA-kvalitet och kvantitet och framgången för efterföljande DNA-amplifiering är beroende av ett antal parametrar före, under och efter extraktion. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till: typ och mängd av vävnad, vilken typ av fixativ som används för vävnad bevara, hur länge till upptagning, ålder paraffin block och lagringsförhållanden samt längden på önskat DNA-segment kan förstärks 1,7. Borttagning av paraffin från vävnaden är det mest kritiska steget för en lyckad extraktion som oupplöst paraffin leder till dålig prov kvalitet och hämning av PCR-amplifiering.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Lam labbet för utvärdering och kritik av denna video och artikel. Detta arbete stöddes av medel från den kanadensiska Institutes for Health Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | VWR international | CABDH6216- 4 | - |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | - |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet International | C0160-B | - |
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
||
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher Scientific | BP1750I-400 | - |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher Scientific | BP1752I-400 | - |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
||
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | - | - |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. oseph, R, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
