Summary
Здесь мы опишем быстрый и простой способ изображения флуоресцентно меченых клеток в полу-ломтики толщиной мозга. Фиксируя, нарезка, и оптически очистки ткани мозга мы опишем, как стандартные epifluorescent или конфокальной микроскопии могут быть использованы для визуализации отдельных клеток и нейронных сетей в нетронутой нервной ткани.
Protocol
1. В местах фиксации мозга
* Подготовить шприц 10 мл (28 иглы), заполненной фосфатным буферным раствором (PBS).
* Подготовить шприц 10 мл (28 иглы), заполненной 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Резервный дополнительные 5-10 мл PFA / PBS для последующей фиксации.
- Inject экспериментальных внутрибрюшинно мыши с летальной дозой Avertin или Nembutal.
- Как только мышь седативные, влажные живота с этанолом и безопасной мыши на дно лотка слоистые с пробкой, воском, или силиконового эластомера использованием рассечение булавки. С животом вверх, безопасный четыре лапы на поверхность - распространяя их как можно шире.
- Захватите кожу щипцами на уровне грудины, и нарезать поперек, чтобы разоблачить печени. Вырезать сбоку, а затем вверх через ребра и диафрагму. Удалить лоскут ткани ребра и продолжают резки до сердца доступна.
- Пирс или надрез правое предсердие стечь циркулирующей крови.
- Флеш остаточной крови из кровеносной системы перфузии PBS через левый желудочек.
- Доступ же отверстие иглы, исправить все мыши последующими перфузии PBS / PFA через левый желудочек.
2. Препарирование мозга и добыча
- Снимите кожу с головы, шеи и черепа, сокращая вокруг канала уха и глаза орбиты, а затем, потянув за кожей кпереди подвергать черепа.
* См. рисунок 2 для иллюстрации шагов 2,2) до 2,5) - Использование кости ножницы, разрезать крест-накрест с высоты сокета носовых раковин костей. Сделайте это для каждой стороны. Поперечную должны быть впереди глаз и обонятельных луковиц.
- Разрезают вдоль друг от ушного канала, чтобы глаз.
- Использование маленькие ножницы рассечение, вырезать затылочной кости пластиной вышележащих мозжечка из одного наружного слухового прохода в другую.
- С той же ножницами рассечение, вырезать вперед по средней линии на уровне обонятельных луковиц.
- Использование пинцета, извлекайте каждый кости пластиной из головного мозга, заботясь, чтобы удалить все соединительные ткани так, что мозг остается неизменным при подъеме от костей.
- Snip оптические и черепно-мозговых нервов, вырезать верхнюю шейного позвонка, и удалить мозг в фиксатор.
- После исправления в течение 1-2 часов при температуре 4 ° С. Промыть 3 раза 15 мин каждый в PBS.
3. Агарозном вложение
- Растопите 2% высокопрочных, низкая точка-гель агарозы типа IB (Сигма номер по каталогу: A0576) в PBS солевых с микроволновой печью.
- Передача расплавленной агарозы в пробирке. Место пробирке в теплой ванне инкубатор или водой (40 ° -41 ° C) до температуры равновесия.
- Клей фиксированные ткани мозга на поршень шприца с образцом цианакрилатного клея (рис. 3А). Кисть тонкий слой насыщенного сахароза-би-эс раствора на поверхность ткани мозга для облегчения последующего высвобождения кольцо агарозы из мозга ломтиками.
- Перенос поршень с мозговой ткани в корпус плунжера (рис. 3В).
- Внесите или залить теплой агарозы в корпус плунжер, покрывая ткани головного мозга. Избежать захвата пузырьков воздуха в агарозы. Пузырьки воздуха в агарозном пойдет на компромисс срез качества.
- Зажим образца шприц с холодной (от 0 ° до -25 ° C) охлаждения блока в течение 1 минуты, чтобы установить агарозы (рис. 3С).
4. Секционирование мозга срез с Compresstome
- Соберите образец шприц, содержащий мозговой ткани в Compresstome (рис. 3D).
- Совместите край лезвия бритвы в тесном контакте с выходом образца шприц (рис. 3Е).
- Заполнение буферная емкость с раствором PBS.
- Поворот микрометра один ломтик толщиной вперед для выдавливания агарозном-мозговую ткань блок из образца шприц.
- Нажмите кнопку "Пуск" на блок управления Compresstome инициировать секционирования процесса.
- Повторите шаги 4,4) до 4,5) до желаемой ломтики получаются на определение толщины.
- Урожай мозга ломтики с кистью или пипеткой флаконах или окрашивания скважин, заполненных с PBS (рис. 3F).
5. Оптический Клиринговый
- Подготовка 75% по объему: том решением глицерина: PBS.
- Налейте (или пипетки) от половины объема PBS вымыть из собранных ломтики мозга.
- Плюс объем удален с глицерином / PBS.
- Разрешить, чтобы уравновесить с нежным смешивания при температуре 4 ° С до раковины ломтиками.
- Повторите шаги 6,2) до 6,4) до конечной концентрации глицерина достигает 75%.
- Замените решение с 90% глицерина в ФБР и позволить, чтобы уравновесить.
* Примечание: Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха при добавлении глицерина решений. Налейте решения медленно и аккуратно перемешать, так как пузырьки воздуха будет вмешиваться в единый equilibraТион и будут перенесены на слайд монтажа.
6. Фрагмент монтажа для работы с изображениями
- Вырезать двусторонняя печать клея (SA-S-1L, Грейс Био-Labs) в открытый прямоугольник по размеру видимой области микро слайд (SuperFrost Кроме того, 25 X 75 X 1 мм, кат. # 48311-703, VWR ) со сторонами 2-3 мм шириной.
- Место мозга ломтики в центре клейкой лентой прямоугольник с помощью пипетки или кистью. Удалите излишки глицерина с нежным аспирации.
- Устройте ломтики мозга на слайде в желаемом порядке с кистью.
- Осторожно опустите покровного стекла (24 X 60 мм, кат. # 48383-139, VWR) на клейкой лентой, следя за тем, чтобы не вводить пузырьков воздуха. Осторожно надавливайте на покровное стекло, чтобы обеспечить контакт с помощью клейкой ленты.
- Аспирируйте избыток глицерина из ребра между горкой и покровного стекла.
- Печать слайдов и покровное с использованием четких лак для ногтей.
- Дайте высохнуть, прежде чем изображение или сохранить долгосрочный слайд ящиках при температуре 4 ° C.
7. Представитель Результаты:
Обработки, визуализации и анализа флуоресцентно меченных мозговой ткани стали незаменимыми для изучения нейробиологии. Многие из этих исследований требуют сложных генетических манипуляций получить репортер выражение в целевых нейронов подмножества, а затем как с низким и высоким разрешением, анализ изображений. Часто экспериментальные и технические ограничения не позволяют получить эти типы данных из того же животного, или в быстрой манере. Подготовка оптически очищается, полу-толстый мозга разделы для флуоресцентной визуализации помогает в этом проблема. Примером нетронутыми толстый ломтик мозга помечены генетически модифицированного вируса бешенства спроектирован, чтобы выразить EGFP и отображаемого использованием epifluorescent и конфокальной микроскопии показано на рисунках 4 и 5 соответственно. Для epifluorescent визуализации мы использовали Leica M205 Англии, так и для конфокальной захвата изображений мы использовали Zeiss LSM 510. Из-за относительной простоты прилагается протокол, этот метод может дать полезные данные изображения из ткани выражения флуоресцентные журналистам с оборотное время менее чем за один день, и совместим как с низким и высоким разрешением световой микроскопии.
Если следователь примет решение включить дополнительные посмертных маркировки методами, иммуногистохимического окрашивания, или сделать тоньше разделы, протокол удлиняется соответственно. Однако описанный выше метод представляет собой простой и относительно высокой пропускной методом проверки моделей жизненное проявление репортером в интактном мозге.
Рисунок 1. Схема diagraming фиксации, рассечение, нарезки, очистки, и монтажные процедуры полу-ломтики толщиной мозга.
Рисунок 2. Схема последовательной резки шаги, чтобы извлечь неповрежденный мозг мыши.
Рисунок 3. Шаги для установки и нарезать мозговой ткани использованием Compresstome. ) Размещение мозговой ткани на режущих поршень использованием суперклеем. B) Рисунок вниз установлен мозговой ткани в поршень для встраивания агарозы. С) Укрепляя плагин агарозном головного мозга с использованием охлажденной блок компрессии. D) Включение агарозном подключить мозг и поршень в камере резки Compresstome. E) Выравнивание лезвие бритвы, чтобы устройство поршень. F), резки и сбор мозга ломтики в камеру буфера Compresstome.
Рисунок 4. Свет изображений микроскопии толстый ломтик с глицерином-очищенный мозговой ткани через лобную кору выражения расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP). А) корональные срез мозга мыши (200 мкм) помечены вирусный вектор выражения EGFP и отображаемого в низком разрешении использования epifluorescent стереоскоп. Шкала бар, 2 мм.
Рисунок 5. Высокая увеличения изображения флуоресцентно меченных слой 5 / 6 корковые нейроны в очищается толстый ломтик мозга. А) Высокое разрешение конфокальной образ максимальной проекции Z-Stack (150 мкм) по региону выделено (рис. 4). Шкала бар, 25 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Учитывая широкое применение использования флуоресцентных белков для целевой нейронов подмножества для исследования с помощью световой микроскопии, заинтересованных в быстром экран, изображение и анализ нейронных сетей в неповрежденной ткани мозга стала бесценным.
Технический прогресс в развитии удобной вирусных векторов, в естественных методов электропорация, и генетически модифицированных линий мышей в настоящее время обеспечивает казалось бы, неограниченный источник меченых типов клеток для проведения расследования. Однако, анализ изображений интактных тканей мозга по-прежнему остается узким местом для экспериментов. Описанный здесь метод оказался чрезвычайно ценным для нашего рутинного анализа мозговой ткани выражения флуоресцентные журналистам. Это значительно урезает время, необходимое для подготовки и анализа тканей мозга разделов, совместим как с низким энергопотреблением и высоким разрешением флуоресценции, может быть использован в сочетании с иммуноцитохимия, является переводимым на других экспериментальных моделях на животных, а главное, в широком смысле применимым к обычной среде лаборатории, которые не могут иметь доступ к съемочной аппаратуры многофотонной. Важно отметить, однако, что оптического просветления с глицерином и других водных и органических растворов имеет практические ограничения. Здесь мы опишем использование глицерина, чтобы помочь очистки мозга ломтиками до 200 мкм. Хотя этот метод работает достаточно хорошо для улучшения изображения разрешение в тканях до 200 мкм, мы не видим улучшения дальше. Другие органические растворители способны очистки ткани далее, однако всегда есть компромисс с потерей (или извлечения) флуоресцентного сигнала.
Возможные вариации описанного выше метода может включать в себя перфузии использованием perstaltic насосы, очистка с другими водных или органических растворителях фазы, которые совместимы с FP флуоресценции, автоматизированные нарезки и серийные изображения, или сопряжения с многофотонной micropscopy, чтобы изображения даже в толстых ломтиков мозга .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Цзянь-Цян Конг сотрудник Precisionary Instruments, Inc, которая производит продукт, используемый в этой статье.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась поддержку через Фонд Макнейр, NARSAD и NINDS грант R00NS064171-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma-Aldrich | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR international | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR international | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | -or equivalent |
References
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
