Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

doi: 10.3791/2808 Published: June 21, 2011

Summary

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Abstract

Mevcut teknolojiler gibi ultrason, MR, PET ve CT gibi tümör görüntüleme için uygun bir xenograftlarının modeli yararını vurgulayarak, mikroskobik düzeyde 1,2,3 tümörleri nanoparçacık alımını değerlendirilmesi için yüksek çözünürlüklü görüntüler veremezken Ayrıntılı alımı analizleri yapmak için hangi. Burada, değiştirilmiş bir kabuk, tavuk embriyo modeli insan tümör xenografts nanoparçacık alımını değerlendirmek için, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme kullanın. Tavuk embriyo modeli özellikle in vivo analizlerde, insan tümörlerinin büyümesini destekleyen, nispeten ucuz ve 4,5 anesthetization veya cerrahi gerektirmez, çünkü bunlar için iyi uygundur . Chorioallantoic membran (CAM) 6 içine implante Tümör hücreleri, 7 gün içinde tamamen vaskülare xenografts oluşturur . Ortaya çıkan tümörler, ya ev sahibi veya tümör sistemleri üzerinde çok az etkisi ile 72 saate kadar korunabilir non-invaziv, gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme tarafından görüntülenmiştir. Tümör distal uygulanan boyutları ve formülasyonları geniş bir yelpazesi ile Nanopartiküller görüntülenebilmekte ve kan yoluyla akışı gibi sayısal olabilir, sızdıran tümör damarsal extravasate ve tümör yerinde biriken. Biz burada, yakın-kızılötesi floresan boyalar ve / veya polietilen glikol (PEG) polimerler 7, 8, 9,10,11 süslenmiş Börülce mozaik virüsü (CPMV) türetilen nanoparçacıkların analizi açıklanmaktadır . Intravenöz üzerine, bu viral nanopartiküller dışında damar küresel etiketleme ve tümör 7,12 içinde hızla endotel hücreleri tarafından içselleştirilmiş. Viral nanopartiküller PEGylation plazma yarılanma ömrü artırır, kan dolaşımını zamanlarını uzatır ve sonuçta gelişmiş geçirgenlik ve retansiyonu (EPR) etkisi 7, 10,11 ile tümörlerin birikimi artırır. Görüntü analiz yazılımı kullanarak bir tümör nanoparçacıkların birikimi hızı ve kapsamı zamanla ölçülür. Bu teknik, hem de görselleştirmek ve insan tümörlerinde nanoparçacık dinamiklerini ölçmek için bir yöntem sağlar.

Protocol

1. Kuş embriyo CAM içine tümör Aşılama

  1. Kabuk az döllenmiş tavuk embriyolar 8 açıklandığı gibi hazırlayın.
  2. Embriyonik gelişim Gün 9, 1 ml şırınga üzerine bağlı 18-gauge iğne kullanılarak bir mikro enjektör montajı. 5-6 inç Tygon boru (1 / 32 "iç çapı, 3 / 32" dış çapı, 1 / 32 "duvar kalınlığı) bir parça kesin ve tüp içine iğne konik dikkatlice yerleştirin. Tüp yaklaşık 4-5 cm iğne ucu kadar uzanır (Şekil 1a).
  3. Hücre süspansiyonu ile şırınga ve tüp doldurun. Daha sonra, boru sonunda mikroenjeksiyon cam iğne takın ve dikkatli bir şekilde herhangi bir hava kabarcıkları.
  4. Gün ışığı ile CAM (Şekil 1c) içinde bolus olarak 10,000-100,000 kanser hücreleri bir diseksiyon kapsamında 9 embriyolar (Şekil 1b) enjekte edilir. Hücreleri enjekte yavaş yavaş ve dikkatli bir iğne CAM içinde görünür bir bolus oluşturmak için hücreleri için doğru yerde olduğundan emin olun. Hücreler CAM yüzeye damla Kimwipe veya diğer aplikatör kullanılarak temizlenebilir.
  5. % 60 nem ve 38 ° C'de nemlendirilmiş inkübatör embriyo dönün ve tümör izin büyümeye ve vascularize (7 güne kadar).

2. Nanoparçacıkların hazırlanması

  1. Tavuk embriyo içine enjeksiyon için floresan etiketli CPMV nanopartiküller hazırlamak için; viral nanopartiküller (herhangi kaldırmak için kullanarak ve bir dakika boyunca santrifüj önce 100 mg / ml Vortex karışımı bir konsantrasyon, PBS, pH 7.4 8 olarak sentezlenmiş sulandırmak toplar. Sonikasyon konjugatları ve agregasyon derecesi bağlı olarak yararlı olabilir 4 saklandığında floresan etiketli CPMVs stokları en az 1 yıl boyunca stabildir ° C karanlıkta bir çift koyarak stokları periyodik olarak kontrol edin bir cam slayt üzerine düşer ve floresan kontrol Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) parçacıklar konjugasyon sonra değişmediğini belirlemek için kullanılır.
  2. Kısaca, viral nanoparçacıkların bir mikrogram (2 ul nihai hacmi) bakır kaplı ızgaraları eklenebilir. Sonra, bir eşit miktarda elektron mikroskobu (Philips EM 410) az 1 dakika süreyle% 2 oranında uranil asetat ekleyin.

3. Floresan etiketli viral nanoparçacıkların İntravenöz enjeksiyon

  1. 16 Gün, yukarıda açıklandığı gibi mikro enjektör montajı. Şırıngaya boru (> 200 mcL) ile viral nanoparçacık istenilen hacmi çizin. Herhangi bir hava kabarcığı dikkatlice çıkarın. Mikroenjeksiyon cam boru sonunda iğne takın. Iğne kadar uzun ve mümkün olduğunca konik (Şekil 2a) olduğundan emin olun. Iğne çok künt ise, ektoderm ile delmek için mümkün olmayacaktır ve gemi nüfuz başarısız olur. Iğne çok keskin ise doku nüfuz ederken, ucu çökecek.
  2. İstediğiniz siteye distal tümör taşıyan embriyo haline intravenöz (Şekil 3d) görüntülenebilmekte 1 mg / ml flöresein dekstran (MW 70.000 Da, Invitrogen) 100 ul enjekte edilir. Başarılı CAM ven kanülasyonu enjeksiyon akış yolu kan temizleme (Şekil 2b) tarafından açıktır. Enjeksiyon sonrası vasküler sızıntı 1 saat değerlendirin.
  3. İstediğiniz siteye distal vasküler sızıntı tümörleri içeren embriyolar halinde intravenöz CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) veya pegile CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) 1 mg / ml solüsyon enjekte 50 ul görüntülenebilmekte.
  4. Görüntü hemen tümörler ve enjeksiyondan sonra bir Yokogawa dönen disk, Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD kamera ile donatılmış bir Zeiss Examiner Z1 dik bir mikroskop kullanılarak her saat.

4. Gerçek zamanlı intravital görüntüleme

  1. Embriyo görüntüleme birimi bir araya getirmek için, vakum gres embriyo görüntüleme ünitesi kapağın alt görüntüleme liman çevresinde ince bir tabaka halinde uygulayın ve liman üzerine 18 mm cam lamel uyacak.
  2. Lamel görüntüleme için istediğiniz alanı kapsayacak böyle embriyo yerleştirin. Lamel yavaşça embriyo ile temas edinceye kadar kapağı düşük ve daha sonra birim üzerine kapağı vidalı bir yerde tutun (Şekil 2c).
  3. Embriyo içeren çanak dışında embriyo görüntüleme ünitesi içine 37 ° C sıcak su ekleyin ve sonra 37 dengelenmiş içinde çevre odasına ° C ile dik bir konfokal mikroskop sahneye tüm birim
  4. İplik disk konfokal floresan mikroskobu (Şekil 2e) altında embriyo içeren Pozisyon görüntüleme ünitesi. Görüntüleme ünitesi yakalanan üç boyutlu Z yığınları ve zaman atlamalı görüntüleri için izin, yer embriyo tutun ve görüş alanı yakalama görüntüleri ise sabit tutmak. Biz kazanmak ve Perkin Elmer (eski Doğaçlama) Volocity yazılım paketi (Şekil 3a) kullanarak üç boyutlu zaman atlamalı görüntüleri analiz. Tümörün üç boyutlu bir yığın yüksek çözünürlüklü ve detaile görselleştirmek için çevreleyen damar kazanmakd belirli bir zaman noktalarında yapısal analizler. Tümör damarsal ayrıntılı yapısal değişiklikler eşlemek için normal süre noktaları üç boyutlu yığınlar edinin. Görüntü tümörler her enjeksiyondan sonra saat.
  5. Hesaplayarak ortalama Alexa Fluor (AF), tümör ya da böyle bir Volocity olarak stroma (non-tümör alan) kullanarak görüntü kantitatif yazılımı (Perkin Elmer) seçilen bölgeler içinde 647 sinyal alımını viral nanoparçacıkların Asitli. Stroma oranı tümör stroma ortalama AF 647 sinyal üzerinde tümörün ortalama AF 647 sinyal bölünmesi ile hesaplandı. Tümör / stroma oranı 1'den yüksek bir nanoparçacık tümörün alındığını olduğunu gösterir.

5. Temsilcisi sonuçları:

Örneğin burada anlatılan, biz günde 9 tavuk embriyolar (Şekil 1b) CAM içinde yaklaşık 1 mm boyutunda bir bolus oluşturmak için HT-29 kolon kanseri hücreleri enjekte etti. Aşılama sonra, embriyolar yeterli tümör büyümesi ve vaskülarizasyon (Şekil 1c) izin nemlendirilmiş bir inkübatör 7 gün süreyle kültüre edildi. Embriyolar tümör vaskülarizasyon onaylamak düşük molekül ağırlıklı dekstran ile intravenöz enjekte edildi ve tümörler Zeiss AxioExaminer Z1 dik mikroskobu (Şekil 2d) altında görüntülendi.

CPMV-AF 647 veya CPMV-PEG-AF 647 nanopartiküller intravenöz uygulamadan sonra (Şekil 3a ve b), yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı konfokal görüntüleme (Şekil 2e) CPMV ve CPMV-PEG hızla tüm damarsal etiketli nanopartiküller saptandı, ancak tümör CPMV-PEG alımı (Şekil 3a) 12 saat sonra, CPMV daha yaklaşık 3 kat daha yüksek oldu. Nanoparçacıkların nispi tümör alımı, görüntü analiz yazılımı (Perkin Elmer Volocity) kullanılarak tespit edildi. Tümör içinde ve dışında ilgi Bölgeler seçildi (stromal bölmesi) ve her birinin ortalama floresan yoğunluğu tespit edilmiştir. Veri tümör / stroma oranı olarak ifade edilir.

Şekil 1
Şekil 1 bir kuş embriyo CAM içine tümörlerin Mikroenjeksiyon. Belirtildiği gibi (a) mikroenjeksiyon cihaz bileşenleri bir araya. (B) 9 gün Kuş embriyolar CAM tüm yüzeyini kapsayacak şekilde yayıldı tümör ile aşılanmış olmak için hazırız. (C) 16 gün, tümör çapı 1 cm (kesikli çizgi) kadar büyüdü ve nanopartiküller ile enjeksiyon için hazır olacak.

Şekil 2
Şekil 2 Nanopartikül enjeksiyon ve intravital görüntüleme. Gösteren bir diseksiyon mikroskop altında enjeksiyon (a), (temizleyerek görülen CAM damar içine enjekte edilir ve (b) mikroenjektör iğne kan akımı enjekte nanopartiküller damar içine eklenir (ok ile gösterilir) ve hazır mikroenjektör iğne ucu kan). (C) Görüntüleme birimi lamel CAM ile doğrudan arabirim ile kuş embriyo içeren. (D) nanoparçacık enjeksiyon öncesinde, tümör vaskülarizasyon floresein dekstran enjeksiyondan sonra intravital görüntüleme ile değerlendirildi. (E) Görüntüleme Ünitesi, 37 ° C sıcaklığa ayarlı muhafaza kümesi içinde dik bir konfokal mikroskop sahnede yer embriyo içeren

Şekil 3
Şekil 3 insan tümörlerinde nanoparçacık alımı intravital görselleştirme. Tümörler (a) CPMV-AF647, (b) CPMV-PEG-AF647 enjeksiyonundan 7 saat sonra görüntülenir. d) sonraki analiz için kuş embriyo tümör eksizyonu.

Discussion

Kuş embriyo chorioallantoic membran (CAM), vasküler dinamikler ve insan tümörlerinde farmakokinetiği değerlendirmek için kullanışlı bir modeldir. CAM yapısı ve konumu, yüksek kalitede görüntü elde etme sağlar ve invaziv cerrahi prosedürler olmaksızın birçok türde kanser xenografts barındırmaktadır. Ayrıca, kanser tümörü xenografts, tümör dokusu nanoparçacıkların birikimi değerlendirmek için hızlı, ucuz ve yarı-yüksek verimlilik anlamına gelir sunan, 7 gün içinde vaskülarize haline chorioallantoic membran yerleştirilir. CAM kabuk az tavuk embriyoların implante kanser xenografts tümör damarsal nanoparçacık alımı ile ilgili bir dik Epifloresans veya konfokal mikroskop, bağlamsal ve zamansal bilgiler yüksek çözünürlüklü optik erişilebilir olduğundan kolayca elde edilebilir. Bu modelde Kanser xenografts az 200 m derinlikte kalarak büyük tümörlerde, CAM üzerinde yanal büyümek eğilimindedir. Standart Epifloresans mikroskopları tüm tümör kitlesi etkin bir şekilde nüfuz eder, çünkü bu, onları özellikle iyi intravital görüntüleme için uygun hale getirir. Buna karşılık, fare içinde yüzeyel veya ortotopik siteleri ya implante tümörler zor non-invaziv teknikleri ile bu tümörler içinde derin nanopartiküller doğru lokalize etmek, üç boyutlu olarak çoğalırlar. Biz geniş bir yelpazede nanoparçacık formülasyonların in vivo analizi için uygun olduğu için bu model için potansiyel vurgulayarak, kuantum noktaları, lipozomlar ve demir oksit, insan tümör xenografts bir dizi nanopartiküller alımını değerlendirmek için bu model kullanılır.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışmada CCSRI Hibe # 700.537 ve CIHR Hibe JDL ve NIH / NCI hibe # CA120711-01A1 ve AZ CA120711-01A1 # 84.535 tarafından desteklenmiştir. Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım yönetmelik ve yönergeler doğrultusunda gerçekleştirilen ve California San Diego, Hayvan Bakım Üniversitesi'nde Komitesi kullanın ve Western Ontario Üniversitesi'nde kullanın.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized leghorn eggs Frey`s Hatchery, St. Jacobs N/A
Dremel rotary tool Dremel Can used any model
Dremel cutoff wheels no. 36 Dremel 409
Sportsman hatcher Berry Hill 1550HA
Sportsman incubator Berry Hill 1502EA
Ethanol 70% (vol/vol)
Polystyrene weigh boats VWR international 12577-01
Square Petri dishes Simport 25378-115
Rubbermaid rubber container with lid Guillevin RH3-228-00-BLU holes drilled into sides
Vertical pipette puller David Kopf Instruments model 720 Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid)

Sodium borosilicate glass capillary tubes

Sutter Instrument Co. BF100-58-10

(OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm

length)
1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11995073
Dulbecco’s Invitrogen 14190250 pH 7.4
Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300054
Fetal Bovine Serum Invitrogen 12483-020 Heat inactivate
Hemocytometer Hausser Scientific 15170-090
Centrifuge Eppendorf 5811 000.010
Fine-point forceps VWR international 25607-856
Tygon R-3603 tubing VWR international 63009-983 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness
Hypodermic needles for injections 18-gauge needles BD Biosciences 305195 Box of 100
1 ml syringes for injections BD Biosciences 309602 Box of 100
Fiber-optic microscope illuminator Amscope HL250-AY 150W
kimwipes VWR international 10805-905
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
Indoor growth lights SunLite, Gardener’s Supply
Methyl-PEO4-NHS ester Pierce, Thermo Scientific PI22341
mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 NANOCS PEG1-0002
Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) Invitrogen A20006
Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * Invitrogen O-6149
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dibasic monohydrogen phosphate Sigma-Aldrich 379980 K2HPO4 (for phopshate buffer)
Monobasic dihydrogen phosphate P5655 KH2PO4 (for phopshate buffer)
Superose 6 size-exclusion column GE Healthcare 17-0673-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare WS-AKTA100
ÄKTA high flow kit GE Healthcare 18-1154-85
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc.
SW 28 Ti rotor Beckman Coulter Inc. 342204 Swing bucket
50.2 Ti rotor Beckman Coulter Inc. 337901 Fixed angle
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC910008 100 kDa cut off
Gradient former Bio-Rad
dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic Invitrogen D1823
Spinning disk confocal fluorescence microscope Quorum Technologies N/A
Epifluorescence wide-field microscope Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss N/A
Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera Quorum; Hamamatsu N/A
Temperature enclosure unit for microscope Precision Plastics N/A
Vacuum grease VWR international 59344-055
Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) VWR international 16004-300
Volocity software PerkinElmer, Inc.
Chick embryo enclosure custom fabricated
Delicate scissors VWR international 25608-203
Formalin BioShop Canada FOR201.500 Use in fumehood
Optimal Cutting Fisher Scientific 1437365
Temperature (OCT)
Plastic moulds Fisher Scientific 22-038217
VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides VWR international 16004-406
Prolong gold with DAPI Invitrogen P36931
Disposable blades for cryostat Fisher Scientific 12-634-2
Cryostat Leica Microsystems 14047033518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
  2. Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
  5. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
  6. Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
  7. Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
  8. Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
  9. Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
  10. Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
  11. Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
  12. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. Forthcoming (2010).
Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cho, C., Ablack, A., Leong, H., Zijlstra, A., Lewis, J. Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging. J. Vis. Exp. (52), e2808, doi:10.3791/2808 (2011).More

Cho, C., Ablack, A., Leong, H., Zijlstra, A., Lewis, J. Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging. J. Vis. Exp. (52), e2808, doi:10.3791/2808 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter