Vi presenterar en ny metod för att kvantifiera nanopartiklar lokalisering i kärlsystemet mänskliga xenografted tumörer med dynamisk realtidsinformation intravital avbildning i en aviär embryo modell.
Nuvarande teknik för bildgivande, såsom ultraljud, MRI, PET och CT, är oförmögna att ge högupplösta bilder för bedömning av nanopartiklar upptag i tumörer på mikroskopisk nivå 1,2,3 och belyser nyttan av en lämplig xenograft modell på sig att utföra detaljerade upptag analyser. Här använder vi högupplösta intravital avbildning för att utvärdera nanopartikel upptag i human tumörvävnad implanterad i en modifierad, skal-mindre kyckling embryo modell. Kycklingen embryot Modellen är särskilt väl lämpad för dessa in vivo-analyser, eftersom det stöder tillväxten av mänskliga tumörer, är relativt billigt och inte kräver anesthetization eller kirurgi 4,5. Tumörceller bildar helt vaskulariserad xenografter inom 7 dagar när implanteras i chorioallantoic membran (CAM) 6. Den resulterande tumörer visualiseras genom icke-invasiv i realtid, med hög upplösning avbildning som kan bibehållas i upp till 72 timmar med liten påverkan på antingen värd eller tumör system. Nanopartiklar med ett brett utbud av storlekar administreras och formuleringar distalt om tumören kan visualiseras och kvantifieras, eftersom de flyter genom blodomloppet, extravasera från läckande tumörvaskulatur och ansamlas i tumören. Vi beskriver här en analys av nanopartiklar från Cowpea viruset (CPMV) dekorerad med nära infraröda fluorescerande färger och / eller polyetenpolymerer (PEG) 7, 8, 9,10,11. Vid intravenös administrering är dessa virus nanopartiklar snabbt internaliseras av endotelceller, vilket resulterar i global märkning av kärlen både utanför och inom tumören 7,12. PEGylering av viral nanopartiklar ökar deras halveringstid i plasma, förlänger sin tid i cirkulationen, och i slutändan ökar deras ackumulering i tumörer genom förbättrad permeabilitet och retention (EPR) effekt 7, 10,11. Hastighet och grad av ackumulering av nanopartiklar i en tumör mäts över tid med hjälp av programvara bildanalys. Denna teknik ger en metod för både visualisera och kvantifiera nanopartikel dynamiken i mänskliga tumörer.
Den chorioallantoic membran (CAM) av aviär embryot är en användbar modell för att bedöma vaskulära dynamik och farmakokinetik av mänskliga tumörer. Strukturen och position CAM tillåter hög förvärv bildkvalitet och rymmer många typer av cancer implanterad utan kirurgiska ingrepp. Dessutom cancer tumörxenografter implanteras i chorioallantoic membranet blir vaskulariserad inom 7 dagar, som erbjuder ett snabbt, billigt och halv-hög genomströmning metoder för att bedöma en ackumulering av nanopartiklar i tumörvävnad. Eftersom cancer implanterad implanteras i CAM skal mindre kyckling embryon är tillgängliga för den högupplösta optik av en rät epifluorescence eller konfokalmikroskop, kontextuella och tidsmässiga information om nanopartikel upptag i tumörvaskulatur lätt kan erhållas. Cancer implanterad i den här modellen tenderar att växa i sidled över CAM, vilket resulterar i tumörer som är stora samtidigt som den är mindre än 200 m djup. Detta gör dem särskilt väl lämpad för intravital avbildning eftersom standarden epifluorescence mikroskop effektivt kan tränga igenom hela tumören massa. Däremot tumörer implanteras i antingen ytlig eller orthotopic platser inom musen förökar sig i tre dimensioner, vilket gör det svårt att exakt lokalisera nanopartiklar djupt inom dessa tumörer av icke-invasiva metoder. Vi har använt denna modell för att bedöma upptag av kvantprickar, liposomer och nanopartiklar av järnoxid i ett antal humana tumörxenografter att belysa de potentiella för denna modell vara lämpliga för in vivo analys av ett brett utbud av nanopartiklar formuleringar.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av CCSRI Grant # 700.537 och CIHR Grant # 84.535 till JDL och NIH / GNI bevilja # CA120711-01A1 och CA120711-01A1 till AZ. Alla försök utfördes i enlighet med de regler och riktlinjer för Institutional Animal Care och använda kommittén vid University of California San Diego, Animal skötsel och användning vid University of Western Ontario.
Reagent Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
Polystyrene weigh boats | VWR | 12577-01 | |
Square Petri dishes | Simport, VWR | 25378-115 | |
Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
Hemocytometer | Hausser Scientific, VWR | 15170-090 | |
Centrifuge | Eppendorf model 5810R | 5811 000.010 | |
Fine-point forceps | VWR | 25607-856 | |
Tygon R-3603 tubing | VWR | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD | 305195 | Box of 100 |
1 ml syringes for injections | BD | 309602 | Box of 100 |
Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
kimwipes | VWR | 10805-905 | |
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce | PI22341 | |
mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
Superose 6 size-exclusion column | GE healthcare life sciences | 17-0673-01 | |
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Amersham Pharmacia | WS-AKTA100 | |
ÄKTA high flow kit | GE healthcare life sciences | 18-1154-85 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Ultracentrifuge | Beckman | ||
SW 28 Ti rotor | Beckman | 342204 | Swing bucket |
50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | Fixed angle |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
Gradient former | Biorad | ||
dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa |
N/A | |
Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
Vacuum grease | VWR | 59344-055 | |
Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR | 16004-300 | |
Volocity software | Perkin Elmer | ||
Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
Delicate scissors | VWR | 25608-203 | |
Formalin | Bioshop | FOR201.500 | Use in fumehood |
Optimal Cutting | Fisher; Tissue Tek | 1437365 | |
Temperature (OCT) | |||
Plastic moulds | Fisher | 22-038217 | |
VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR | 16004-406 | |
Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
Disposable blades for cryostat | Fisher | 12-634-2 | |
Cryostat | Leica CM 3050 S | 14047033518 |