Summary

Оценка наночастиц в опухоли в реальном времени с помощью Прижизненные изображения

Published: June 21, 2011
doi:

Summary

Мы представляем новый подход к количественному наночастиц локализации в сосудистой от человека xenografted опухолей с использованием динамических, в режиме реального времени прижизненных изображений в модели птичьего эмбриона.

Abstract

Современные технологии для визуализации опухоли, такие, как УЗИ, МРТ, ПЭТ и КТ, не в состоянии уступить изображений высокого разрешения для оценки наночастиц в опухолях на микроскопическом уровне 1,2,3, подчеркивая полезность подходящую модель ксенотрансплантата , в которых проводить детальный анализ поглощения. Здесь мы используем высоким разрешением прижизненной визуализации для оценки наночастиц в опухоли человека ксенотрансплантаты в модифицированном, раковины менее куриного эмбриона модели. Модель куриный эмбрион особенно хорошо подходят для этих анализов в естественных условиях, поскольку он поддерживает рост опухолей человека, является относительно недорогим и не требует анестезии или хирургического вмешательства 4,5. Опухолевые клетки образуют полностью васкуляризированной ксенотрансплантаты в течение 7 дней, когда имплантируется в chorioallantoic мембраны (CAM) 6. В результате опухоли визуализируются с помощью неинвазивных в реальном времени с высоким разрешением изображения, которые могут быть сохранены в течение 72 часов с минимальным воздействием на любой хост или опухоли систем. Наночастицы с широким диапазоном размеров и составов вводить дистальнее опухоли могут быть визуализированы и количественно по мере их прохождения через кровь, вытекать из сосудов в ткань с вытекающей сосудистая опухоль, и накапливаются в опухоли. Мы описываем здесь анализ наночастиц основе вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), украшенная ближней инфракрасной флуоресцентные красители и / или полиэтиленгликоль полимеров (ПЭГ) 7, 8, 9,10,11. После внутривенного введения этих вирусных наночастиц быстро усвоены эндотелиальных клеток, что приводит к глобальной маркировки сосудистую как снаружи, так и внутри опухоли 7,12. PEGylation от вирусных наночастиц увеличивает их полувыведения, расширяет свое время в обращении, и в конечном итоге повышает их накопления в опухоли через повышенной проницаемости и удержания (ЭПР) эффект 7, 10,11. Скорость и степень накопления наночастиц в опухоли измеряется в течение долгого времени с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Этот метод дает метод как визуализировать и количественно наночастиц динамики в опухолях человека.

Protocol

1. Прививка от опухоли в CAM птичьего эмбриона Подготовка оболочки менее оплодотворенных эмбрионов куриных, как описано 8. На 9-й день эмбрионального развития, собрать микро-инжектор использованием 18-иглы подключены на 1 мл шприца. Вырезать 5-6 дюймов кусок Tygon трубки (1 / 32 "внутренний диаметр, 3 / 32" наружный диаметр, 1 / 32 "толщина стенки) и аккуратно вставьте скос иглы в трубку. Примерно 4-5 дюймов трубки должны простираются от кончика иглы (рис. 1а). Заполните шприц и трубку с клеточной суспензии. Затем вставьте иглу микроинъекции стекла в конце трубы и тщательно удалить пузырьки воздуха. Inject День 9 эмбрионов (рис. 1б) при вскрытии прицел с подсветкой с 10000-100000 раковые клетки в виде болюса в течение CAM (рис. 1в). Медленно вводить клетки и тщательно обеспечить, чтобы игла находится в правильном месте для клеток для формирования видимых болюсно в CAM. Клетки, которые капать на поверхность CAM можно чистить с помощью Kimwipe или других аппликатора. Вернуться эмбрионов увлажненный инкубаторе при температуре 38 ° С при влажности 60% и позволяет опухоли расти и vascularize (до 7 дней). 2. Подготовка наночастиц Для подготовки флуоресцентно меченных CPMV наночастиц для введения в куриный эмбрион, разбавленный вирусных наночастиц (синтезируется как в 8 в PBS, рН 7,4, до концентрации 100 мкг / мл смеси Vortex задолго до того, использование и центрифуги в течение одной минуты, чтобы удалить. агрегатов. ультразвука также может быть полезна в зависимости от конъюгатов и степени агрегации. Запасы флуоресцентно меченных CPMVs стабильны в течение не менее 1 года при условии хранения при 4 ° С в темноте. Проверьте запасы периодически, поставив пару капель на предметное стекло и проверка флуоресценции. просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) также может быть использован для определения того, частицы остались нетронутыми после сопряжения. Короче говоря, один микрограмм вирусных наночастиц (в конечном объеме 2 мкл) могут быть добавлены к медным покрытием сетки. Затем добавьте равный объем 2% уранилацетата в течение 1 минуты на электронном микроскопе (Philips EM 410). 3. Внутривенное введение флуоресцентно меченных вирусных наночастиц На 16 день, сборки микро-инжектор, как описано выше. Составление требуемого объема вирусных наночастиц через шланг в шприц (> 200 мкл). Осторожно удалите воздушные пузырьки. Вставьте иглу микроинъекции стекла в конце трубы. Убедитесь, что игла тех пор, и конические, насколько возможно (рис. 2а). Если игла слишком тупой, он не сможет проникнуть через эктодермы и не сможет проникнуть в судно. Если игла слишком острым, кончик рухнет, когда проникающая ткани. Внутривенно вводят по 100 мкл 1 мг / мл флуоресцеина декстрана (70000 МВт Да, Invitrogen) в опухоли эмбриона подшипников дистальнее нужный сайт для визуализации (рис. 3). Успешная катетеризация вены CAM видно по очистке крови в пути инъекции потока (рис. 2б). Оценка сосудистой утечки через 1 час после инъекции. Внутривенно вводят 50 мкл 1 мг / мл раствора CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) или пегилированного CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-ПЭГ-AF 647) в эмбрионы содержащие опухоли с сосудистой утечки дистальных от желаемого сайта быть визуализированы. Изображение опухоли сразу и каждый час после инъекции использованием Zeiss Ревизора Z1 прямой микроскоп оснащен диском Yokogawa спиннинг, Хамамацу ImagEM 9100-12 EM-CCD камерой. 4. В реальном времени прижизненной визуализации Чтобы собрать блок эмбриона изображений, нанесите тонкий слой вакуумной смазки по окружности изображений порта на нижней крышке устройства визуализации эмбриона, и соответствовать 18 мм стекло покровное на порт. Позиция эмбриона, что покровное будет охватывать требуемую область для работы с изображениями. Медленно опустите крышку, пока покровное просто вступает в контакт с эмбриона, а затем винтовой крышкой на единицу, чтобы удерживать его на месте (рис. 2). Добавить воды, нагретой до 37 ° С в блок визуализации эмбриона вне блюдо с эмбриона, а затем поместить весь блок на сцену вертикально конфокальной микроскопии с внутренней экологической камеры доведены до 37 ° C. Установите копи содержащие эмбриона под вращающийся диск конфокальной микроскопии флуоресценции (рис. 2е). Копи проведет эмбриона на месте и держать в поле зрения фиксированной во время захвата изображения, позволяющий как для трехмерных стеков Z и покадровой изображения, которые будут захвачены в плен. Мы приобретаем и анализа трехмерных покадровой изображения с помощью Перкин Элмер (ранее импровизация) Volocity пакет программного обеспечения (рис. 3а). Приобретать высоким разрешением трехмерные стопки опухоли и окружающих сосудистой визуализировать detaileг структурного анализа в определенных временных точках. Приобретать трехмерных стеков в основное время, указывает на карте подробные структурные изменения в сосудистую сеть опухоли. Изображение опухоли каждый час после инъекции. Количественного поглощения вирусных наночастиц рассчитать среднее Alexa Fluor (AF) 647 сигнала в отдельных регионах в опухоли или в строме (неопухолевой область) с использованием образа программного обеспечения, таких как количественный Volocity (Perkin Elmer). Опухоли стромы соотношение было рассчитывается путем деления средней AF 647 сигнал в опухоли на длине AF 647 сигналов в строму. Опухоль / стромы соотношение выше, чем 1 указывает, что наночастицы, рассматриваемых опухоли. 5. Представитель результаты: В примере, описанном здесь, мы вводили HT-29 клетки рака толстой кишки в форме болюса примерно 1 мм размера в течение CAM дня 9 куриных эмбрионов (рис. 1b). После прививки, эмбрионы культивировали в течение 7 дней в увлажненном инкубаторе разрешить достаточный рост опухоли и васкуляризации (рис. 1в). Эмбрионы вводили внутривенно с низким молекулярным весом декстран для подтверждения васкуляризации опухоли и опухоли были визуализированы под Zeiss AxioExaminer Z1 прямой микроскоп (рис. 2г). После внутривенного введения CPMV-AF 647 или CPMV-ПЭГ-AF 647 наночастиц (рис. 3а, б) высокого разрешения в режиме реального времени конфокальной микроскопии (рис. 2е) показало, что оба CPMV и CPMV-ПЭГ наночастицы быстро помечены всей сосудистой сети, но поглощение CPMV-ПЭГ на опухоль была примерно в 3 раза выше, чем CPMV после 12 часов (рис. 3а). Относительное поглощение наночастиц опухоли определяли с помощью анализа изображений программное обеспечение (Volocity от Perkin Elmer). Интересующие регионы были выбраны в пределах и за пределами опухоли (в стромальных ящиком) и средняя интенсивность флуоресценции каждого был определен. Данные выражается как опухоль / стромы отношение. Рисунок 1. Микроинъекция опухолей в CAM от птичьего эмбриона. () Микроинъекции аппарат собирается из компонентов, как указано. (Б) Птичий эмбрионов на 9-й день готовы к засевают опухоли, когда CAM распространился, чтобы покрыть всю поверхность. (С) На 16-й день, опухоль вырастет до до 1 см в диаметре (пунктирная линия) и готов к инъекции наночастиц. Рисунок 2. Инъекции наночастиц и прижизненной визуализации. Инъекция под рассечение микроскопа () кончик иглы microinjector готовы быть введен в вену CAM и (б) иглы microinjector вставляется в вену (указано стрелкой) и наночастиц вводят в кровоток (если смотреть в безналичном крови). (С) изображений единица, содержащая птичьего эмбриона с покровным сопряжены непосредственно с CAM. (Г) До наночастиц инъекции, васкуляризация опухоли оценивается с помощью прижизненного изображения после введения флуоресцеина декстран. (Е) изображений единица, содержащая эмбрион расположен на этапе вертикально конфокальной микроскопии в пределах температуры регулируемой набора корпуса до 37 ° C. Рисунок 3. Прижизненное визуализации наночастиц в опухолях человека. Опухоли визуализируются 7 часов после инъекции () CPMV-AF647 и (б) CPMV-ПЭГ-AF647. г) Иссечение опухоли от птичьего эмбриона для последующего анализа.

Discussion

Chorioallantoic мембраны (CAM) от птичьего эмбриона полезной модели для оценки динамики и сосудистой фармакокинетику опухолей человека. Структура и положение CAM позволяет с высокой приобретение качество изображения и вмещает многих видов рака ксенотрансплантаты без инвазивных хирургических процедур. Более того, ксенотрансплантаты раковой опухоли имплантируются в chorioallantoic мембраны стать васкуляризированной в течение 7 дней, предлагая быстрый, недорогой и полуфабрикатов высокой пропускной средства для оценки накопления наночастиц в опухолевой ткани. Поскольку раковые ксенотрансплантаты имплантированы в CAM оболочки менее куриные эмбрионы были доступны для высокого разрешения оптики вертикально epifluorescence или конфокальной микроскопии, контекстная и временной информации о наночастиц в сосудистую сеть опухоли могут быть легко получены. Рак ксенотрансплантаты в этой модели, как правило, растут с боков через CAM, что приводит к опухоли, которые являются большими, оставаясь при этом менее 200 м в глубину. Это делает их особенно хорошо подходит для прижизненной визуализации потому что стандартные epifluorescence микроскопы могут эффективно проникать всю массу опухоли. В отличие от опухолей, имплантированных в любом поверхностными или ортотопической сайтов внутри мыши размножаются в трех измерениях, что делает ее трудно точно локализовать наночастиц глубоко внутри этих опухолей путем неинвазивных методов. Мы использовали эту модель для оценки поглощения квантовых точек, липосомы и наночастицы оксида железа в число человеческих ксенотрансплантаты опухоли, подчеркивает потенциал для этой модели, чтобы служить для в естественных условиях анализ широкого спектра наночастицы формулировки.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано CCSRI Грант № 700537 и CIHR Грант № 84535 на ЛЗЕ и NIH / NCI грант № CA120711-01A1 и 01A1-CA120711 на AZ. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и руководящими принципами институциональной уходу и использованию животных комитета в Университете Калифорнии в Сан-Диего, уходу за животными и использование в Университете Западного Онтарио.

Materials

Reagent Name/Equipment Company Catalogue Number Comments
Fertilized leghorn eggs Frey`s Hatchery, St. Jacobs N/A  
Dremel rotary tool Dremel   Can used any model
Dremel cutoff wheels no. 36 Dremel 409  
Sportsman hatcher Berry Hill 1550HA  
Sportsman incubator Berry Hill 1502EA  
Ethanol     70% (vol/vol)
Polystyrene weigh boats VWR 12577-01  
Square Petri dishes Simport, VWR 25378-115  
Rubbermaid rubber container with lid Guillevin RH3-228-00-BLU holes drilled into sides
Vertical pipette puller David Kopf Instruments model 720 Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid)

Sodium borosilicate glass capillary tubes

Sutter Instrument BF100-58-10

(OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm

length)
1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11995073  
Dulbecco’s Invitrogen 14190250 pH 7.4
Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid      
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300054  
Fetal Bovine Serum Invitrogen 12483-020 Heat inactivate
Hemocytometer Hausser Scientific, VWR 15170-090  
Centrifuge Eppendorf model 5810R 5811 000.010  
Fine-point forceps VWR 25607-856  
Tygon R-3603 tubing VWR 63009-983 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness
Hypodermic needles for injections 18-gauge needles BD 305195 Box of 100
1 ml syringes for injections BD 309602 Box of 100
Fiber-optic microscope illuminator Amscope HL250-AY 150W
kimwipes VWR 10805-905  
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A  
Indoor growth lights SunLite, Gardener’s Supply    
Methyl-PEO4-NHS ester Pierce PI22341  
mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 NANOCS PEG1-0002  
Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) Invitrogen A20006  
Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * Invitrogen O-6149  
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418  
Dibasic monohydrogen phosphate Sigma 379980 K2HPO4 (for phopshate buffer)
Monobasic dihydrogen phosphate   P5655 KH2PO4 (for phopshate buffer)
Superose 6 size-exclusion column GE healthcare life sciences 17-0673-01  
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Amersham Pharmacia WS-AKTA100  
ÄKTA high flow kit GE healthcare life sciences 18-1154-85  
Sucrose Sigma S0389  
Ultracentrifuge Beckman    
SW 28 Ti rotor Beckman 342204 Swing bucket
50.2 Ti rotor Beckman 337901 Fixed angle
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore UFC910008 100 kDa cut off
Gradient former Biorad    
dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic Invitrogen D1823  
Spinning disk confocal fluorescence microscope Quorum; Yokogawa
CSU 10, Yokogawa
N/A  
Epifluorescence wide-field microscope Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss N/A  
Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera Quorum; Hamamatsu N/A  
Temperature enclosure unit for microscope Precision Plastics N/A  
Vacuum grease VWR 59344-055  
Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) VWR 16004-300  
Volocity software Perkin Elmer    
Chick embryo enclosure   custom fabricated  
Delicate scissors VWR 25608-203  
Formalin Bioshop FOR201.500 Use in fumehood
Optimal Cutting Fisher; Tissue Tek 1437365  
Temperature (OCT)      
Plastic moulds Fisher 22-038217  
VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides VWR 16004-406  
Prolong gold with DAPI Invitrogen P36931  
Disposable blades for cryostat Fisher 12-634-2  
Cryostat Leica CM 3050 S 14047033518  

References

  1. Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
  2. Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
  5. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
  6. Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
  7. Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
  8. Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
  9. Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
  10. Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
  11. Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
  12. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , (2010).

Play Video

Cite This Article
Cho, C., Ablack, A., Leong, H., Zijlstra, A., Lewis, J. Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging. J. Vis. Exp. (52), e2808, doi:10.3791/2808 (2011).

View Video