Summary

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Published: December 03, 2011
doi:

Summary

המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

Abstract

זיהום מיקרוביאלית של הסביבה מהווה סיכון בריאותי משמעותי. קלאסי אינדיקטורים צואתי חיידקי הראו שיש מגבלות משמעותיות, וירוסים הם עמידים יותר בפני תהליכי איון הרבה אינדיקטורים צואה רגילה לא להודיע ​​על מקור הזיהום. פיתוח חסכונית שיטות ריכוז של וירוסים ממים מבחני מולקולרית מקלה את הישימות של וירוסים כאינדיקטורים לזיהום צואתי ו חיידקים כמו מעקב אחר המקור (MST) כלים. Adenoviruses ו polyomaviruses הם נגיפי DNA מדביק בעלי החוליות כולל בני אדם ספציפיים, ומופרשים בצואה בהתמדה ו / או שתן בכל האזורים הגיאוגרפיים למד. במחקרים קודמים, הצענו כימות adenoviruses האנושי (HAdV) ו polyomaviruses JC (JCPyV) על ידי ה-PCR כמותי (qPCR) כאינדקס של זיהום צואתי אנושי. לאחרונה, פיתחנו מבחני qPCR עבור כימות מסוים של porcine adenoviruses (PAdV) ו polyomaviruses שור (BPyV) כסמנים של זיהום צואתי חיה עם רגישויות של עותקים בגנום 1-10 לכל מבחנה. במחקר זה, אנו מציגים את והנוהל לזהות את מקור הזיהום בדגימות מים באמצעות כלים אלה. כדוגמה נציג של תוצאות, ניתוח של וירוסים במים הקרקע הצגת רמות גבוהות של חנקות מוצג.

איתור של וירוסים במים מזוהמים נמוך או בינוני דורש ריכוז של וירוסים מ לפחות כמה ליטרים של מים לתוך נפח קטן בהרבה, הליך שבדרך כלל כולל שני שלבים ריכוז בסדרה. זו פרוצדורה מסורבלת במקצת ואת השתנות נצפתה החלמה ויראלי משמעותי בסל עיבוד בו זמני של מספר גדול של דגימות המים.

על מנת למנוע את צוואר הבקבוק נגרמת על ידי שני שלבים נהלים יישמנו פרוטוקול צעד אחד שפותח studie הקודםs ו החלים על מגוון של מטריצות מים. ההליך כולל: החמצה של עשרה ליטר דגימות מים, הפתתה על ידי חלב דל שומן, שקיעה הכובד של חומרי flocculated, אוסף של המשקע ו צנטריפוגה, resuspension של המשקע במאגר פוספט 10 מ"ל. להתרכז ויראלי משמש להפקת חומצות גרעין ויראליות ואת adenoviruses ספציפיים polyomaviruses של הריבית על ידי לכמת qPCR. מספר גבוה של דגימות עשוי להיות מנותח בו זמנית בשיטה זו עלות נמוכה ריכוז.

הנוהל הוחל על ניתוח של מי ים, מי ים ומים הנהר במחקר זה, אנו מציגים תוצאות ניתוח דגימות מי התהום. שיטה זו תפוקה גבוהה כמותי אמין, פשוט, וחסכוני.

Protocol

1. ריכוז של חלקיקים נגיפיים נוכח דגימות מים אוסף ומיזוג של דגימות מים איסוף מינימום של 2 משכפל של L 10 לדגימה במכלי פלסטיק עם תחתית שטוחה דגימה אחת נוספת כמו בקרת תהליך. מד?…

Discussion

ההליך המתואר היו מקיימים את התנאים של שיטה מתאים שגרתי במעבדות בריאות הסביבה והציבור: לשחזור, אמינה, פשוטה וחסכונית. פרוטוקול היא פשוטה, אך היא חייבת להיות מלווה בזהירות. מוליכות נמוכה בדגימות מבלי להוסיף את הריכוז המבוקש של מלחי ים מלאכותי יהיה להפחית באופן דרמט?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הממשלה הספרדית "Ministerio de Educación y Ciencia" (פרויקט AGL2008-05275-C01/ALI), על ידי האיחוד האירופי למחקר Framework 7 פרויקטים במימון VIROBATHE (חוזה מס '513648), VIROCLIME (חוזה מס' 243923 ) ועל ידי הסוכנות קטלאנית של מים, Agència Catalana de l'Aigua (ACA), Departament דה קונטרול אני Millora dels Ecosistemes Aquatics. במהלך המחקר פיתחו מרתה Rusiñol היה בחור של ממשלת קטלאנית "AGAUR" (FI-DGR).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
High speed centrifuge (8,000xg) Berckman Coulter Avanti J-20XP  
pH-meter, thermometer and conductimeter Afora LPPC3003  
Plastic tubes 100-200 cm length Deltalab 350059  
Sterile graduated disposable pipettes Labclinics PN10E1  
Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) Afora KA298/00  
Centrifuge pots (500 mL) Fisher Scientific SE5753512  
Magnetic stirrers and magnets (one per sample) Fisher Scientific 10510  
Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers Deltalab 191642  
A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) Watson-Marlow 323E/D  
Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours Deltalab 900400  
Hydrochloric acid (1N and 0.1N) Panreac 141020.1611  
Sodium hydroxide (1N) Panreac 131687.1211  
Artificial seawater sea salts Sigma S9883  
Skimmed milk (SM) Difco 232100  
Phosphate buffer pH 7,5     1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5
Thiosulphate Panreac 121879.1209 Make a 10% solution in water
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904  
96-well optical reaction plate (500 units) Applied Biosystems 43426659  
Optical adhesive covers (100 units) Applied Biosystems 4311971  
TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x Applied Biosystems 4396838  

References

  1. Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
  2. Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  3. Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  4. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
  5. Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
  6. Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
  7. Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
  8. Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
  9. de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
  10. Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
  11. Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
  12. Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).

Play Video

Cite This Article
Bofill-Mas, S., Hundesa, A., Calgua, B., Rusiñol, M., Maluquer de Motes, C., Girones, R. Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses. J. Vis. Exp. (58), e2820, doi:10.3791/2820 (2011).

View Video