En av de patologiska egenskaperna hos AD är bildandet av protein Amyloid β positiva neuritic plack. I detta protokoll beskriver vi två metoder för att upptäcka neuritic plack i transgena möss AD modell: immunhistokemisk detektion med hjälp av ABC-och DAB-metoden och fluorescerande upptäckt med hjälp av thioflavin S färgningsmetod.
Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste neurodegenerativa sjukdom som leder till demens. Neuritic plack är en av de patologiska kännetecken för Alzheimers sjukdom. Den centrala komponenten i neuritic plack är en liten fintrådiga protein som kallas amyloid β protein (A-beta) 1, som härrör från sekventiell proteolytisk klyvning av beta-amyloid prekursor protein (APP) med β-sekretas och γ-sekretas. Den amyloid hypotesen innebär att Aγ innehåller plack som underliggande toxiska mekanismen i AD patologi 2. Den obduktion analys av förekomsten av neuritic plack bekräftar diagnosen AD. För att ytterligare vår förståelse av Aγ neurobiologi i AD patogenes har olika musstammar uttrycker AD-relaterade mutationer i mänskliga APP gener genereras. Beroende på svårighetsgraden av sjukdomen, kommer dessa möss utvecklar neuritic plack i olika åldrar. Dessa möss fungerar som ett ovärderligt verktyg för att studera patogenes och utveckling av läkemedel som kan påverka den vägen APP bearbetning och neuritic plackbildning. I detta protokoll använder vi en immunhistokemiska metod för detektering av neuritic plack hos möss AD modell. Vi kommer särskilt att diskutera utarbetandet från utvinna halv hjärna, paraformaldehyd fixering, cryosectioning och två metoder för att upptäcka neurotiska plack i AD transgena möss: immunhistokemisk detektion med hjälp av ABC-och DAB-metoden och fluorescerande upptäckt med hjälp av thiofalvin S färgningsmetod.
Immunohistokemi använder biotinylerad märkt 4G8 antikropp fläckar neuritic plack i AD modellerad möss med specificitet. Färgningen Resultatet låter kvantifiering och jämförelse av plack belastning mellan olika behandlingsgrupperna. Det finns flera viktiga steg som skulle kunna påverka resultatet. Eftersom Hemi hjärnor inte är perfusion innan extraktionen från skallen ska försiktighet användas under extraheringen för att förhindra skador på Hemi hjärnan. Eftersom den Hemi hjärnan är passivt perfusion, rekommenderar vi inkubera den i 4% PFA i minst 48 timmar vid 4 ° C före sänka ned i 30% sackaroslösning. Alternativt kan transcardial perfusion göras innan utvinna hjärnan. Om hjärnan är korrekt monterad, bör den ha en gummiaktig konsistens. I de fall där hjärnan inte är fast på rätt sätt, kommer de avsnitt riva lätt i D'Olomos lösningen eller under färgning förfaranden.
Den 4G8 monoklonala antikroppen är reaktiv till aminosyrarester 17-24 av A-beta och erkände epitop på kärnan sekvens (VFFAE). Eftersom 4G8 kommer från mus arter, tenderar det att ge högre bakgrundsfärgning. Därför valde vi att inkubera sektionerna vid den angivna utspädning med hänsyn till att uppnå en verklig signal samtidigt minimera bakgrundsfärgning.
Förutom att immunfärgning för neuritic plack detektion med 4G8 antikropp, är ett thioflavin S färgningsmetod också användas för att identifiera plack. Thioflavin S är en homogen färg blandning som är resultatet av metylering av dehydrothiotoluidine med sulfonsyra. Thioflavin S icke-selektivt binds beta ark innehållet av proteiner, som de i amyloid oligomerer. Vid bindande, genomgår thioflavin en karaktäristiska blå förskjutning av dess emissionsspektrum. Omvänt thioflavin S bindning till Monomera former inte kommer att locka fram en blå skift och kunde inte detekteras med fluorescerande mikroskop. Thioflavin S färgning ger ett snabbt alternativ till skärmen för amyloid som fluorescensintensiteten ger bra visualisering av små mängder av amyloid insättningar. Men det är en nackdel om thioflavin S färgning bristen på specificitet. Många andra vävnader komponenter inklusive innehåller omfattande beta ark, som fibrinoids, hyaline, keratin, etc, har en ganska affinitet för denna färg.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR), den Townsend familjen, och Jack Brown och Familj Alzheimers Research Foundation (till WAS). WS är innehavaren av Kanada forskning ordförande i Alzheimers sjukdom. PTTL stöds av naturvetenskaplig och teknisk forskning biträde och Michael Smith Stiftelsen för hälsoforskning stipendium.
Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
Entellan | EM science | 65037-71 |
Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Cryostat | Leica | CM-3050-S |
MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |