אחד המאפיינים הפתולוגיים של אלצהיימר היא היווצרות של חלבון הפלאק עמילואיד β חיובי מדלקת עצבים. בפרוטוקול זה נתאר שתי שיטות לאיתור פלאק מדלקת עצבים בעכברים הטרנסגניים מודל AD: זיהוי immunohistochemical באמצעות ABC ו-DAB שיטת זיהוי פלורסנט באמצעות שיטת מכתים S thioflavin.
מחלת אלצהיימר (AD) הינה ההפרעה השכיחה ביותר ניווניות המוביל לדימנציה. היווצרות הפלאק מדלקת עצבים הוא אחד מסימני ההיכר הפתולוגי של מחלת אלצהיימר. המרכיב המרכזי של הפלאק מדלקת עצבים הוא חלבון קטן המכונה אמילואיד β פילמנטיות חלבון (Aβ) 1, אשר נגזר מחשוף proteolytic רציפים של החלבון בטא עמילואיד המבשר (APP) על ידי secretase-β ו – γ-secretase. ההשערה עמילואיד כרוך כי Aγ המכילים הפלאק כמנגנון רעילים הבסיסית לספירה הפתולוגיה 2. ניתוח שלאחר המוות של נוכחות של פלאק מדלקת עצבים מאשרת את האבחנה של א"ד. כדי לקדם את ההבנה שלנו של Aγ לנוירוביולוגיה בפתוגנזה לספירה, עכבר זנים שונים להביע את AD-הקשורים מוטציות בגנים APP האדם נוצרו. בהתאם לחומרת המחלה, עכברים אלו יפתחו הפלאק מדלקת עצבים בגילאים שונים. עכברים אלה משמשים כלי רב ערך לחקר התפתחות בפתוגנזה סמים העלולים להשפיע על עיבוד APP מסלול ורובד היווצרות מדלקת עצבים. בפרוטוקול זה, אנחנו מעסיקים immunohistochemical שיטה לגילוי ספציפי של הפלאק מדלקת עצבים בעכברים מודל AD. אנו במיוחד לדון הכנה לחילוץ מן המוח וחצי, קיבעון paraformaldehyde, cryosectioning, ואת שתי שיטות לאיתור פלאק נוירוטי בעכברים הטרנסגניים לספירה: זיהוי immunohistochemical באמצעות ABC ו-DAB שיטת זיהוי פלורסנט באמצעות שיטת מכתים S thiofalvin.
אימונוהיסטוכימיה באמצעות biotinylated כתמים שכותרתו נוגדן 4G8 הפלאק מדלקת עצבים לספירה מודל עכברים עם סגוליות. התוצאה מכתים מאפשרת כימות והשוואה של עומס פלאק בין קבוצות הטיפול השונות. ישנם צעדים מכריעים שיכולים להשפיע על התוצאה. מכיוון שכל חמי אינם perfused לפני מיצוי מהגולגולת, טיפול אמור לשמש במהלך תהליך החילוץ, כדי למנוע נזק למוח חמי. יתר על כן, מאחר שהמוח הוא חמי perfused פסיבי, אנו ממליצים דוגרים אותו PFA 4% עבור 48 שעות לפחות ב 4 ° C לפני הצללה בפתרון סוכרוז 30%. לחלופין, זלוף transcardial יכול להיעשות לפני לחילוץ המוח. אם המוח הוא קבוע כראוי, זה צריך להיות מרקם צמיגי. במקרה שבו המוח אינו קבוע כהלכה, קטעי יהיה בקלות לקרוע בפתרון ד Olomos או במהלך ההליכים מכתים.
נוגדן חד שבטי 4G8 היא תגובתי שאריות חומצת אמינו 17-24 של Aβ והכיר epitope ברצף הליבה (VFFAE). מאז 4G8 נגזר מינים העכבר, הוא נוטה לתת מכתים רקע גבוהה יותר. לפיכך, בחרנו דגירה בסעיפים בדילול המצוין עם שיקולים להשגת אות נכון, תוך מזעור מכתים רקע.
בנוסף immunostaining לאיתור פלאק מדלקת עצבים באמצעות נוגדן 4G8, שיטה מכתים S thioflavin משמש גם כדי לזהות את הפלאק. Thioflavin S הוא תערובת הומוגנית לצבוע הנובעת מתילציה של dehydrothiotoluidine עם חומצה sulfonic. Thioflavin S הלא סלקטיבי נקשר תוכן גיליון בטא של חלבונים, כגון אלה oligomers עמילואיד. לאחר מחייב, thioflavin עובר שינוי כחול אופייני של ספקטרום הפליטה שלו. לעומת זאת מחייב S thioflavin לצורות monomeric לא לעורר שינוי כחול ולא ניתן היה לזהות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מכתים S Thioflavin מספק אלטרנטיבה מהירה המסך עמילואיד כמו עוצמת הקרינה מאפשר ראיה טובה של כמויות קטנות של משקעים עמילואידיים. עם זאת, חיסרון אחד על מכתים S thioflavin היא חוסר ייחוד. רבים מרכיבים רקמות אחרות המכילות כולל הסדינים בטא נרחב, כגון fibrinoids, hyaline, קרטין, וכו ', יש זיקה ולא עבור צבע זה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הקנדי מחקר (CIHR), משפחת טאונסנד, וג'ק בראון מחקר משפחה אלצהיימר קרן (אליו היה). הוא היה בעל הקתדרה למחקר בקנדה מחלת אלצהיימר. PTTL נתמך על ידי למדעי הטבע יועצת הנדסה מחקר סמית מיכאל קרן מלגות מחקר בריאות.
Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
Entellan | EM science | 65037-71 |
Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Cryostat | Leica | CM-3050-S |
MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |