Summary
Трансплантация мыши нервные стволовые клетки (NSCs) в спинной мозг мышей с установленными демиелинизации подробно. Подготовка NSCs, ламинэктомия грудного позвонка 9 (T9), а также трансплантация NSCs изложена наряду с пред-и послеоперационного ухода за мышами.
Abstract
Мышей, инфицированных штаммом нейротропных JHM вируса гепатита мыши (MHV) разработать патологические и клинические результаты похожи на пациентов с демиелинизирующих заболеваний рассеянным склерозом (MS). Мы показали, что трансплантация NSCs в спинной мозг больных результаты мышей значительное улучшение в обеих ремиелинизации и клиническим исходом. Сотовые замены терапии для лечения хронических неврологических заболеваний в настоящее время реальности и в естественных условиях модели имеют жизненно важное значение для понимания связей между привитых клеток и микроокружения тканей хозяина. Данная презентация представляет собой адаптированный метод пересадки клеток в спинной мозг JHMV-инфицированных мышах. Короче говоря, мы предлагаем процедуру я) подготовка NSCs до пересадки, II) дооперационной заботы о мышах, в) воздействие спинного мозга через ламинэктомии, внутривенно) стереотаксической инъекции NSCs и IV), послеоперационный уход .
Protocol
1. Подготовка
- Подготовка Ксилазин-кетамин решение (Кетамин регулируемого вещества. Подробные отчеты должны храниться и решений хранятся в надежном, запираемом помещении).
- Чистота и стерилизации оборудования.
- Подготовка операции области, вытирая с асептическим агентом, а затем покрытие с стерильных полотенец бумаги, а также создать микроманипулятора.
2. Подготовка клетки для трансплантации
- Клетки должны быть ресуспендировали в концентрации 100000 клеток / Е л и, хотя только 250 тысяч клетки пересаживают на мышь, избыток клеток, необходимых для загрузки шприца целей (подготовить по крайней мере 300 000 клеток на мышь получения клеток).
- Вымойте клетки для пересадки 3 раза в HBSS в 50 мл конические пробирки. Граф клетки до окончательного отжима.
- После окончательного спином вниз, переливать HBSS и оставьте флакон в перевернутом положении, чтобы предотвратить попадание капель гранул.
- Сухие стены внутри с УФ-облучении, стерильные Kimwipe. Не позволяйте гранулы для просушки.
- Холдинг трубки в вертикальном положении, медленно и очень осторожно ресуспендируют клетки в половине окончательного желаемого объема HBSS.
- Меры общего объема пипетированием большинство суспензии в наконечник пипетки, а затем настройкой дозвона на pipetter, пока вся подвеска на кончике пипетки. Она скажет вам, сколько еще HBSS необходимо для желаемой концентрации.
- Довести объем до необходимого количества, добавив HBSS.
- Место обратно на лед. Проверка жизнеспособности клеток, если они должны быть на льду в течение более 2 часов.
3. Подготовка мышей для хирургии и трансплантации
- Анестезию мыши, внутрибрюшинного введения кетамина (100mg/kg) и ксилазина (10mg/kg) в ~ 100 мкл доз или эквивалент анестезии. Вся процедура от хирургического приготовительные для наложения швов займет 30-40 минут.
- (Дополнительно: применить нумерацию, цветную ленту к хвосту каждой мыши для обеспечения идентификации)
- Бритье спинной области мышь от поясницы до шеи, и расширение двусторонних 2 см от средней линии, с электрической машинкой. Волосы следует срезать как можно ближе (это может быть необходимо перейти на площадь несколько раз).
- Для того чтобы удалить оставшиеся волосы, нанесите тонкий слой крема удаления волос (Nair) с марлей наконечником аппликатором.
- Через 1-2 минут, протереть Наир с марлей слегка смачивают водой с мылом. Благоустроенная территория должна быть чистой голой кожи без каких-либо бродячих куски волос, которые могут попасть в рану во время последующего хирургического вмешательства.
Стерилизовать подготовленный участок с йодистым раствором.
4. Ламинэктомия
- Часто изменения и / или стерилизовать перчатки на протяжении всей процедуры. Поместите мышь спинной стороны с головой указывая на левой (если вы правша). Пелерина животных для обеспечения стерильности, и что только бритые области подвергается. Сделайте вертикальный разрез (~ 1.3cm) по laminecomy сайт охватывает примерно от грудных позвонков T8 для T12.
- При Грефе пинцет состоялась в левую руку, твердо безопасный позвоночника на Т9 (рис. 1А) и поднимите курсор вверх, чтобы преувеличить искривление позвоночника.
- Используйте скальпель забить стык между T10 и T11, пространство между двумя колючие выступы. Далее подвергайте стык, тщательно слом мышечного слоя от подвергать кости (см. рис 1B, С).
- Используйте ножницы, чтобы дальнейшее ясно мышцы от пластинки и вокруг ножки с маленькими ножницами. Это откроет небольшое пространство между позвонками. Медленно и осторожно вставить одно лезвие ножниц в эту щель и СНиП ножке. Убедитесь в том, кривизна ножницы всегда расположены горизонтально, вдали от мозга. Повторите с другой стороны. (См. рис 1D, E)
- Поднимите пластинки подвергать мозга и тщательно надрез его. Убедитесь, что не оставляет никаких свободных или зубчатых фрагменты костей позади. (См. Рисунок 1F)
- До инъекции, чистки крови покончить с стерильные тампоны хлопок.
5. Инъекции клеток
- Прикрепить иглу с иглой гайку шприца Гамильтона и очистить их с помощью промывки несколько раз водой, затем 70% этанола, и, наконец, HBSS. Вставьте поршень после каждого залить водой, 70% этанол, или HBSS.
- Подготовка шприца Гамильтона для сотовых загрузки, удалив поршень и ослабления иглы гайки и вытягивать иглу от шприца для предотвращения обратного давления. Убедитесь, что тщательная обработка иглы и гайки сделаны с стерильные перчатки.
- Нагрузка 15μl клеток в кончике пипетки и нажмите наконечник плотно в задней части шприца для загрузки клеток в шприце.
- Вставьте поршень около 5 мм и затяните гайку иглы.
- Выжмите поршень ООНсезам некоторые из клеточной суспензии видно выхода иглы.
- Убедитесь Есть нет пузырьков в шприц и лежал шприц вниз в горизонтальном положении, чтобы предотвратить клетки от принятия градиент силы тяжести.
- Схватить laminectomized мышь мышц остистой мышцы подключения шипами Т8 и Т9 (рис. 2, б).
- Зажим кровоостанавливающий зажим с левой (вертикальной) микроманипулятора руку так, чтобы передние лапы мыши находятся в воздухе и его задние лапы слегка касаясь платформы стерильных бумажных полотенец, как на рисунках 2А и 2В.
- Прикрепите шприц, чтобы правая рука микроманипулятора (при 70 ° угол) и слайд-шприц, чтобы нижнее положение возможно, до зажима.
- Стабилизировать мыши, закрепив ее хвостом по бумажные полотенца и медленно опустите шприц (рис. 2В).
- Опустите иглу в направлении мозга и вставить иглу 1 мм в противоположном полушарии через спинной средней линии (рис. 2С). Кончике иглы должна быть в сером веществе недалеко от центрального канала.
- Медленно вводить 2.5μl клеток. Вводите в размере 1 мкл / 5 секунды. После инъекции клеток, подождать 10 секунд и отказаться от иглы десятую свою очередь, в то время, каждые 10 секунд, пока игла находится вне мозга. Обратите внимание на возможный отток клеточной суспензии.
- Быстро убрать шприцы и отделить ее от микроманипулятора руку. Положите шприц горизонтально.
- Отпустите кнопку мыши, и трансфер в таблице наложения швов.
- Повторите шаги 5.7-5.14 для каждой мыши, пока шприц опустел. Стерилизуйте инструменты (в стерилизатор) и иглы (путем протирания этанол) между животными. Отменить клеток и перезагрузки, если наносить удар видна.
- Чистый шприц, как в шаге 5,1 между нагрузками.
6. Швы и послеоперационный уход
- Шовный разрез. Шовный игла вводится в поверхностной фасции по обе стороны разреза. Поток через нанизанные, потянув поверхностной фасции вместе (рис. 3А), тем самым покрытие подвергается спинного мозга на сайт удален пластинки. Не шва кожных мышц придает коже или скелетных мышц спины. Вытяните нить через все, оставив примерно 1 / 2 ". Использование иглодержателя, три узла формируются и нить обрезается как можно ближе к узлу, насколько возможно.
- Закрыть разрез с применением 2:58 скобы (в зависимости от размера разреза) на кожу (рис. 3б). Осторожно потяните кожу от мыши, чтобы избежать сшивания основные мышцы.
- Использование 26G3 / 8 иглу вводят 0,5 мл лактата Рингера подкожно в нижнюю часть спины от разреза.
- Наведите обратно в свою клетку. Чтобы убедиться, что он может дышать комфортно, находясь под наркозом, мыши должны быть размещены на его стороне в клетки, избегая контакта между сайтом хирургии и клетка постельных принадлежностей. Клетки должны быть размещены на грелки.
- Мыши контролироваться после анестезии прекратит свое действие для обеспечения кровотечение стихает, швы остаются закрытыми, и что у мышей, возвращения к предшествующему операции мобильности.
- Лечить мышей одно время с анальгетик бупренорфин (0,05-0,1 мг / кг) после операции.
- Обеспечить нарушением мышей имеют достаточного доступа к пище и воде: бутылки с водой оснащены расширенной 3,5-дюймовый носики и мышей, которые не могут ходить вручную подается вода и / или калорийные пищевой добавки (Nutri-Cal, Tomlyn).
7. Представитель Результаты:
Желаемый результат будет идентифицировать из-за отсутствия оттока клеточной суспензии во время инъекции и нетронутыми появление спинного мозга после процедуры. В связи с этим, очень важно иметь яркое и прямое освещение на спине мыши во время ламинэктомии и во время инъекции. Оптимальное освещение способствует волоконно-оптических освещения (рис. 2А).
Рисунок 1 - Ламинэктомия () После позвонка T9 прочно, проведенных с пинцетом Грефе, (B, C) оценка позвоночника с скальпелем между T10 и T11 для облегчения ввода микро-ножниц.. (D) Аккуратно вставьте микро ножницами через пространство между T10 и T11 (стрелки и вставка, Е) и вырезать ножки с каждой стороны (тире, E), чтобы освободить спинные пластинки. (F) Флип пластинки до рострально и его отрезать.
Рисунок 2. Инъекция NSCs. (А) общие настройки микроманипулятора с кровоостанавливающего проведение мыши прилагается к левой руке и шприц Гамильтон на правой руке на 70 угла. (B) кровоостанавливающего держать мышцы остистой мышцы подключения шипами T8 и T9. (C) игла опускается через тОн средней линии и в сером веществе на противоположном полушарии, проксимальнее центрального канала.
Рисунок 3. Швы и закрытия раны. () Швы применяются к поверхностной фасции по обе стороны разреза. (B) разрез закрыт с 2-3 скобы по мере необходимости (один основной показано на рану нуждающихся 3).
Discussion
Хорошо выполняется пересадка будет зависеть в первую очередь на осторожны ламинэктомии и инъекции клеток. Первичного ловушка, чтобы избежать во время ламинэктомии является повреждение спинного мозга. Это может произойти во время самой процедуры или повреждения, вызванные резким костных фрагментов оставил после процедуры. Чтобы избежать этих, убедитесь, что точки изогнутые ножницы микро всегда обращена от мозга и внимательно изучить laminectomized позвоночника обеспечить, чтобы все фрагменты костей будут очищены, и что оставшиеся позвоночные структура не имеет откровенно выступающими или зазубренные края.
Как упоминалось ранее, обнаружение истечения будет возможно, если свет сияет ярко и непосредственно на открытой спинного мозга во время инъекции. Истечение, скорее всего, произойдет с 30-иглы (по сравнению с 33 калибр), и если инъекция делается слишком быстро. Хотя этот протокол дает нам хорошие результаты, а другие сообщали дольше период ожидания (до 5 минут) до втягивания иглы после инъекции 8,9. Кроме того, меньшие иглы калибровочных предпочтительнее, но мы заметили, что некоторые клетки слишком легко лизируются при прохождении через иглы 33 калибра.
Для обеспечения максимальной эффективности, пересадки команда комплектования четырех различных станций (мышь приготовительные, ламинэктомия, нагнетания и швов) является желательным. Кроме того, сроки проведения каждой процедуры должны быть оптимизированы, чтобы минимизировать время клетки ждут на льду. Например, мы трансплантации наши мышей в группах по четыре (количество доз в каждой нагрузки шприц), человек инъекционных клетки начинает загрузку шприц после третьего мышь была laminectomized и человек, готовивший мышей должна обезболить следующие группы после второй мыши предыдущей группы была laminectomized. Таким образом, мы можем трансплантации клеток (или контроля средств массовой информации) в 40 мышей примерно через 3 часа, хотя каждая мышь займет около 30-40 мин.
Сотовые замены терапии для лечения некоторых расстройств ЦНС в настоящее время в клинических испытаниях 10. Существует не заменит для прижизненного моделей НСК трансплантации и наш протокол для приживления NSCs в спинной мозг мышей с вирусным индуцированной демиелинизации облегчает использование важной моделью рассеянного склероза, а также может быть легко адаптированы для других моделей.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaject | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-542-02 | |
| Xylazine Hydrochloride | MP Biomedicals | 158307 | |
| Nair | Church & Dwight Co. | ||
| 10 μl Hamilton Syringe w/ Removable needle | Hamilton Co | 7635-01 | |
| Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel | Hamilton Co | 7803-077803-05 | Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use |
| Micro Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | |
| Small Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1772 Universal Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1773 Electrode Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 902 small animal stereotaxic | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 960 left electrode carrier | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 95057-064 | |
| Lactated Ringers | Hospira Inc. | NDC 0409-7953-03 | |
| Staples | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13010-12 | |
| Scalpels, sizes 10,11 | Fisher Scientific | 268878, 268879 | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 1676G | size 5-0, 3/8" circle, 19mm needle, 45cm braided thread |
| Reflex 7 wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12502-12 |
References
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Weiner, H. L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease. Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).
- Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).
- Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).
- Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).
- Blakemore, W. F., Crang, A. J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , Oxford UP. Oxford. (1992).
- Liu, S. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).
- Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).
- Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).
