Summary
Hier haben wir eine Methode zur Wirksamkeit von Medikamenten-Tests mit chirurgischen Proben von Hirntumoren, sogenannte "Tumor-Explantat-Methode". Mit dieser Methode können wir Wirksamkeit von Medikamenten ohne die Mikroumgebung von soliden Tumoren zu bewerten. Zur Validierung Zuverlässigkeit dieser Methode beschreiben wir repräsentative Daten mit unseren Gliom Probe mit der gängigen First-Line Chemotherapeutikum Temozolomid behandelt.
Abstract
Die derzeitigen Therapien bei malignen Gliomen haben nur palliative Wirkung. Für die therapeutische Entwicklung, ist eine Hürde die Diskrepanz der Wirksamkeit durch aktuelle Wirksamkeit von Medikamenten-Tests und die Wirksamkeit am Patienten bestimmt. Somit sind neue und zuverlässige Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln in der vorklinischen Phase gewährleistet. In-vitro-Kultur von Tumorgewebe, einschließlich Zelllinien, hat erhebliche phänotypische, genetischen und epigenetischen Veränderungen von Krebszellen durch künstliche Umgebung von Zellkultur verursacht, die nicht unbedingt die Biologie der ursprünglichen Tumoren in situ. Xenograft-Modellen mit der immundefizienten Mäusen haben auch Einschränkungen, dh das Fehlen von Immunsystem und Interspezies genetischen und epigenetischen Unterschiede in Mikroumgebung. Hier zeigen wir eine neue Methode mit der chirurgischen Proben von malignem Gliom undissoziierten Tumorblöcke auf die Behandlung Auswirkungen zu bewerten. Zur Validierung dieser Methode werden die Daten mit der aktuellen First-Line-Chemotherapeutikum Temozolomid (TMZ), beschrieben.
Wir nutzten die frisch entfernt chirurgischen Exemplar malignem Gliom für unsere Experimente. Wir führten intratumorale Injektion von TMZ oder anderer Wirkstoffkandidaten durch Inkubation und Analysen über chirurgische Proben verfolgt. Hier haben wir versucht, ein Tumorgewebe Explantation Methode als eine Plattform, um die Wirksamkeit von neuartigen Krebstherapien bestimmen zu etablieren, so dass wir in der Lage zu überwinden, zumindest einige der derzeitigen Einschränkungen und füllen die Lücke zwischen der aktuellen experimentellen Daten und die Wirksamkeit auf einer tatsächlichen Patienten Tumor. Diese Methode kann das Potenzial haben, zu beschleunigen Identifizierung neuartiger Chemotherapeutika für feste Krebsbehandlung.
Protocol
1. Vorbereitung der Medien
- Die Medien wurden unter Verwendung von 10% FBS (16140-071 - GIBCO) in DMEM/F-12 (1X), Liquid 1:1 (10565-042 - Invitrogen) mit 0,6% Agar-Lösung gereinigt, granuliert (1.01614.1000-EMD ). Sterile Bedingungen waren während des gesamten Versuchs beibehalten.
- Für die Herstellung von Medien 5mL der FBS (16140-071 - GIBCO) wurde 45ml DMEM/F-12 (1X) hinzu, Liquid 1:1 (10565-042 - Invitrogen) machen Endvolumen von 50 mL. Die vorbereiteten Medien wurde im Wasserbad bei 37 ° C Temperatur gehalten.
- Die Agar-Lösung wurde hergestellt unter Verwendung von Wärme Mikrowellen-Methode. 0,3 Gramm Kristallzucker Agar wurde in 50 mL destilliertem Wasser mit Mikrowelle aufgelöst. Die Agar-Lösung wurde abgekühlt auf 37 ° C Temperatur, indem sie es in das Wasserbad.
- Wir haben gleiches Volumen von Medien aus Schritt 1,2 und 1,3 und bereitete Stammlösung. Das Verhältnis von 0,6% Agar (0,5 ml) und 10% FBS-D-MEM/F-12 Medien (0,5 ml) wurde 1:1, so dass das Gesamtvolumen von 1 ml in jedes Well der 6-Well-Platten.
2. Tissue Verarbeitung
- Glioblastoma multiforme (GBM) Gewebe wurden sofort nach der Operation von Department of Pathology erhalten. Das Gewebe wurde als GBM vom Department of Pathology eingestuft.
- Das Gewebe wurde auf patri-Platte mit einer Pinzette vorsichtig überführt und mit eiskaltem 5mL 1XPBS für 3-fache.
- Serielle Teile der Proben wurden aus dem seziert Proben geschnitten, um Tumor-Blöcke (ca. 10 mm im Durchmesser) mit einem Skalpell (Feather-2976 # 10) und ForceP (Fisher Scientific) zu schaffen.
- Die Blöcke wurden in einer 6-Well-Platte übertragen. Jedes Well wurde mit 1ml von Medien in Schritt 1.4 zu nennen. Das Gewebe hatte genug an der Luft zu halten Gewebe lebensfähig.
- Tumor-Blöcke wurden dann entweder mit DMSO (5%) oder TMZ (2,5 nM) injiziert und inkubiert 16 Stunden bei 37 ° C in angefeuchteter Luft mit 5% CO2. 0,1 ml DMSO (5%) oder TMZ wurde 3-mal in der Tumor-Blöcke injiziert an verschiedenen Orten für die konsequente Behandlung. Das Medikament injiziert wurde, mit Insulinspritze 1ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort Point-26027).
- Nach 16 Stunden Blöcke wurden mit 5 ml 1XPBS für 3-mal gewaschen. Nach dem Waschen der Blöcke wurden mit 10 ml 10% v / v Formalin für 24 Stunden (Ricca Chemical Company) in 50 ml-Röhrchen (Basix-5539802) fixiert und für die in Paraffin eingebetteten 4 &mgr; m Abschnitte.
- Die Formalin-fixierten Abschnitt wurde in Becherglas auf der Rührplatte mit "Keine Wärme" platziert und bearbeitet durch die folgenden Lösungen für 30 Minuten in jeder Lösung. 30% Ethanol, 50% Ethanol, 75% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol.
- Das Gewebe wurde auf Küchenpapier abgetupft und in geschmolzenem Paraffin (58 bis 60 ° C, Fisher Paraplast Paraffin) für 30 Minuten.
- Das Gewebe in Formen mit Surgipath Blue Ribbon Paraffin eingebettet war, wurde eingebetteten Gewebe auf Raumtemperatur abgekühlt.
- Paraffin eingebettete Gewebeschnitte wurden 4 &mgr; m entnommen und auf Fisher Plus-Objektträger.
3. Immunhistochemie
Die Immunhistochemie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. 1
- Entparaffinierung und Rehydrierung Objektträger in ein Rack, und führen Sie folgende Schritte aus. Xylol für 3x5 Minuten (3-mal für 5 Minuten), 100% Ethanol für 3x5 Minuten, 95% Ethanol für 1x5 Minuten, 70% Ethanol für 1x5 Minuten in fließendem Leitungswasser für 3 Minuten ausspülen.
- Antigen-Retrieval mit Wärme induzierte Epitopdemaskierungslösung Tauchen Dias in 1X Citratpuffer (Thermo Scientific-AP9003-500) in destilliertem Wasser in ein Becherglas verdünnt. Kochen für 15 Minuten auf einer Heizplatte (stellen Sie sicher, Abschnitte don "t fallen aus der Folie). Die Lösung wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Folien mit 1X PBS für 3x5 Minuten.
- Die Hemmung der internen Peroxid Tauchen die Folien in Methanol (Fisher Scientific-A-452 bis 4) mit 0,3% Wasserstoffperoxid (Fisher in destilliertem Wasser Scientific-BP2633-500-verdünnt) in einem Becherglas 15 Minuten lang. Spülen in 1X PBS für 3x5 Minuten.
- Blocking Abdeckung des Gewebes mit 10% normalem Ziegenserum. Die Objektträger in einer feuchten Box und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Folien mit 1X PBS für 3x5 Minuten.
- Menschen spezifische Caspase-3 (1:1000, R & D Systems, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) mit 1X PBS verdünnt: Primäre Antikörper Schnitte wurden über Nacht bei 4 ° C mit dem Primärantikörper bei folgenden Konzentrationen inkubiert. Spülen Sie die Folien in 1X PBS 3x10 Minuten auf den nächsten Tag.
- Sekundäre Antikörper-Reaktion Abdeckung des Gewebes mit 2-3 Tropfen HRP markierten sekundären Antikörper (vorstellen Systeme). Legen Sie Folien in einer feuchten Box und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen mit 1X PBS für 3x10 Minuten.
- Spurensuche für die Chromogen DAB-Kit (Vector Laboratories-SK-4100) Entwicklung für die Erkennung von primären Antikörper nach dem Protokoll des Herstellers.
- Gegenfärbung Tauchen Sie die Dias mit Hämatoxylin (10-15 s econds, stellen Sie sicher, don "t überrannt DAB-Signal). Spülung mit fließendem Leitungswasser für 3 Minuten.
- Dehydration Tauchen Sie die Folien in folgender Reihenfolge, 70% Ethanol für 5 Minuten, 95% Ethanol für 5 Minuten, 100% Ethanol für 3x5 Minuten, Xylol für 3x5 Minuten.
- Deckglas die Folien mit permount Montage-Reagenz (Fisher Scientific-SP-15 bis 100).
- Bilder wurden mit Olympus-Fluoreszenzmikroskop (DP-72) .3.11). In allen Experimenten wurde spezifische Markierung durch die Negativ-Kontrolle ohne Primärantikörper bestätigt.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Wir sammelten chirurgischen Proben des Glioblastoma multiforme (GBM). Die Patienten erhielten eine der ersten Operation ohne vorherige Chemotherapien einschließlich Temozolomid (TMZ). Die T1-gewichteten Bild der MRT mit Gadolinium Enhancement in Abbildung 1a gezeigt-eine verbesserte Tumor im rechten Stirnlappen vor der Operation. Die postoperative Bild (Abb. 1b) bestätigt subtotale Entfernung der Läsion nach der Operation. Die chirurgische Gewebe wurden an das Department of Pathology für die klinische Diagnose Zweck geschickt, und die restlichen Exemplare wurden an die Gewebeentnahme im Rahmen des genehmigten Institutional Review Board (IRB)-Protokoll an der Ohio State University Medical Center verarbeitet. Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung zeigte die Anwesenheit von Nekrosen, pseudopallisading Zellen und mikrovaskuläre Proliferation (Abb. 1-c). So wurden diese Tumoren histopathologisch als GBM diagnostiziert. Zu beachten ist, erhalten Tumor Explantate nach Inkubation ohne TMZ bis zu 48 Stunden der Zytoarchitektur der GBM. Im Gegensatz dazu mit Inkubation für 72 Stunden oder länger, wir die erhöhte Anzahl der kondensierten Kerne in den Proben festgestellt, was darauf hindeutet einige der Tumorzellen beginnen, Apoptose. Als Ergebnis enthielt Tumorgewebe nach längerer Inkubationszeit lückenhaft Regionen, die Tumorzellen, die bevorzugt in und um Nekrosen (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurden verloren.
Um zu untersuchen, ob dieser Tumor Explantation Proben zuverlässig für die Zwecke der Wirksamkeit von Medikamenten testen genutzt werden, testeten wir die Wirkung des TMZ-Behandlung. Abbildung-2 stellt den Ablauf der Experimente in dieser Studie. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass intratumorale Injektion von TMZ stärker auf das Wachstum auswirken Kontrolle von malignen Gliomen ist als die der systemischen Verabreichung dieses Medikaments 2. Nach Inkubation für 16 Stunden wurden diese Explantate mit Paraffin-und serielle Schnitte wurden für die Färbung vorbereitet eingebettet. Immunhistochemie von TMZ behandelten GBM Gewebe zeigte eine erhebliche Reduzierung der Ki-67-positive Tumorzellen im Vergleich mit den Kontrollproben. Im Gegenzug hat die Immunhistochemie mit einem Apoptose-Marker, Caspase-3, keine signifikanten Unterschiede zwischen TMZ behandelt Gliom Proben und die Kontrollproben (Abbildung-3).
Treatment-Effekt mit TMZ wurde durch die Kombination dieser Explantation Ansatz zusammen mit entweder in vitro-Kultur oder Durchflusszytometrie charakterisiert. Genauer gesagt, haben wir versucht, die Auswirkungen auf die Stammzellen-like Tumorzellen (SCLTC) zu bestimmen. Daher folgende intratumoralen Behandlung mit TMZ, führten wir Kugel-Assay und Durchflusszytometrie dieser Tumor Explantate. Die TMZ behandelten Proben wurden dissoziiert in einzelne Einzelzellen und diese einzelnen Zellen wurden in einer geringen Dichte ausgesät (1 Zelle pro Mikroliter oder weniger) in 96-Well-Platten in serum-freiem Medium mit bFGF und EGF ergänzt. In der Kontrollgruppe wurde die Bildung von Tumor-Kugeln aus dem Tumor Explantate nach 7 Tagen Inkubation beobachtet. Da die Kugel Bildung einer Eigenschaft SCLTC 3 4 ist, zeigt Änderungen in der Zahl der Tumor-Kugeln durch eine medikamentöse Behandlung die Wirkung auf SCLTC. Ebenso wurde der Durchflusszytometrie der dissoziierten Tumor Explantate mit einem Zelloberflächenmarker, CD133, aus der Wirkung auf SCLTC verifizieren. Wenn SCLTC in heterogenen Tumorzellen in GBM selektiv durch eine medikamentöse Behandlung beseitigt werden, könnte man sagen voraus, dass die Durchflusszytometrie sollten Abnahme des CD133-positive Fraktion durch Behandlung (Daten nicht gezeigt) zu erkennen.
Figure.1 Kernspintomographien (MRI) eines Patienten GBM. Representative Zahlen von vor der Operation Bild-1a und nach der Operation Bild-1b. Figure-1c ist H & E Färbung von frischen GBM Gewebeprobe. Original-Vergrößerung, 40X.
Abbildung. 2 Die experimentellen Strom von Block Kultur Experiment. Figure-2a. Bild von frischen chirurgischen GBM erhielt von der Pathologie. Figur-2b zeigt Dissection von Tumor-Block in 10mm kleine Stücke mit Hilfe chirurgischer Klinge. Figure-2c ist das Medikament (TMZ) Behandlung von Tumor-Blöcke mit Insulinspritze.
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Abbildung. 3 Immunhistochemie. Immunhistochemie von GBM Gewebe Blöcke mit DMSO oder TMZ mit aktivierter Caspase-3 und Ki67 injiziert. Hämatoxylin wurde für die Kernfärbung verwendet. Original-Vergrößerung, 40X.
Discussion
Es besteht eine Kluft zwischen der Wirksamkeit von Medikamenten in der aktuellen präklinischen experimentellen Modelle und die Wirksamkeit bei Patienten. Genauer gesagt, in den Hirntumor Forschungsgebiet, sind neu und zuverlässige Methoden erforderlich, dass würde helfen, die Lücke zwischen dem Medikament Auswertung mit den aktuellen Methoden und die Wirksamkeit bei Patienten. Der beschriebene Test in dieser Studie ist ein zusätzlicher Vorteil, wenn nicht eine Lösung zu erleichtern füllen die Diskrepanz der experimentellen Daten und die Ergebnisse der betroffenen Patienten.
In-vitro-Zellkulturen bevorzugt erweitern bestimmten Tumor Zelltypen unabhängig von den Kulturbedingungen und stellen nur eine Subpopulation der gesamte Tumor. 5 Darüber hinaus tritt genetische und phänotypische Umwandlung der künstlichen Zelle Expansion und ist mit dem langfristigen Zellkulturen unvermeidlich . Eine der wichtigsten Hürden zu malignem Gliom zu behandeln, ist die Heterogenität der Tumorzellen, sowohl innerhalb eines einzelnen Tumors und zwischen Tumorproben 6, 7. Daher selektiven Anreicherung von einer bestimmten Population von Tumorzellen, unabhängig von einen oder anderen Art, kann kein geeignetes Mittel, um die Wirksamkeit von Chemotherapeutika auf heterogenen Tumorzellen zu bestimmen. 8 9 Jede Tiermodell von Hirntumoren aus einer Subpopulation von abgeleiteten Tumorzellen vergossen Lichter an der Wirksamkeit von Arzneimitteln auf einer Subpopulation, aber nicht den gesamten Tumor.
Mehrere Einschränkungen, auf der anderen Seite, noch in diesem Tumor Explantation Methode bleiben. Eine solche Einschränkung ist die relativ kurze Dauer der Behandlung. Da bösartige Tumorzellen betrachtet werden, Beständigkeit gegen die meisten zu erwerben, wenn nicht alle Therapien im Laufe der Zeit, erste Kontrolle des kurzfristigen Wachstums der Tumorzellen kann nicht durch die langfristige Prognose der Patienten berücksichtigt werden, wurde erst mit einem Anti-gemeldet Angiogenese-Medikament, Bevacizumab 10. So ist die Verbesserung des Protokolls für diesen Test zur Explantation Gewebe über einen längeren Zeitraum zu bewahren mit weiteren Untersuchungen erforderlich. Eine andere Frage ist eine spezifische Wirkung des getesteten Medikaments auf SCLTC in den Tumor. Da SCLTC relativ resistent gegenüber der aktuellen Therapien bei malignen Gliomen, die Identifizierung von neuartigen Anti-Krebs-Medikamente, die dabei wirksam beseitigen SCLTC gerechtfertigt ist sind. In diesem Zusammenhang haben wir derzeit versuchen, diese Explantat-Assay mit der anschließenden Kombination in vitro-Experimenten, wie Neurosphäre-Assay (Daten nicht gezeigt). Wir erwarten, dass mehr über die Auswirkungen zu lernen, wenn überhaupt, der ein Arzneimittelkandidat auf SCLTC durch diese kombinierte Tests. Schließlich kann die Verwendung von kleinen Blöcken von Tumorproben nicht den gesamten Tumor Zellpopulationen, wie es der Fall mit der konventionellen Tumor-Zelllinien oder primären Kulturen aus chirurgischen Proben. Diese Fragen beiseite, die Erhaltung Tumorstroma, einschließlich der vaskulären Nische, ist hilfreich bei der Charakterisierung der Umweltfaktoren für Tumorzellen. Daher kann dieser Test haben das Potenzial für eine therapeutische Strategien unter einer physiologisch relevanten Bedingungen zu evaluieren.
Hier haben wir einen Test zur Wirksamkeit von Medikamenten-Tests mit Explantaten von chirurgischen Exemplare der GBM. In der Tat, mit der geprüft chirurgischen Proben fanden wir, dass eine direkte Injektion von TMZ Verbreitung in der GBM Proben reduziert. Dieses Gewebe Explantation Methode ist theoretisch auch für andere solide Tumoren und stellt Gewinn für Wirksamkeit von Medikamenten bei einem Patienten der Tumor, die hoffentlich helfen wird, uns zu vermeiden ein weiteres Scheitern in klinischen Studien für Krebserkrankungen zu bestimmen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die American Cancer Society (MRSG-08-108 bis 01), Vincent J. Sgro / The American Brain Tumor Association, und der Khan Family Foundation denn ich Nakano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat-Inactivated | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| D-MEM/F-12 (1X) Liquid 1:1 | Invitrogen | 10565-042 | |
| Agar-Agar Purified, Granulated | EMD Millipore | 1.01614.1000 | |
| DPBS for staining | Invitrogen | 14190 | |
| Hematoxyllin | Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| 10% w/v formalin Caspase-3 | Ricca Chemical Company | 3810 | |
| Caspase-3 | R&D Systems | AF835 | |
| Ki67 | Dako | 15626 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Envision system- anti-mouse | Dako | 2012-07 | |
| Envision system- anti-rabbit | Dako | 2011-12 | |
| DAB-kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Table 1. Materials. | |||
| 6 Well Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Petri dish | VWR international | 25384-302 | |
| Serological pipette | Axygen Scientific | ||
| Filter tips | USA Scientific, Inc. | ||
| 500 μm polyester mesh Netwell insert | Costar | 3480 | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 354230 | |
| BD 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Hypodermic needle Aluminum Hub. | Tyco Healthcare, Covidien | 2000029 | |
| Tissue culture flask | Corning | ||
| Centrifuge tubes | Basix | 5539800 | |
| Thin wall tubes | Eton | 1107A | |
| Surgical Blade stainless steel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976#10 | |
| Insulin Syringe | Comfort point | 26027 | |
| 50mL flat top screw cap tube | Basix | 5539802 | |
| Dissection microscope | Tritech Research, Inc. | ||
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | DP-72 | |
| Forcep | Fisher Scientific | ||
| Table 2. Equipment. | |||
References
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- Heimberger, A. B. Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats. Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).
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