Summary
Här har vi etablerat en metod för läkemedlets effektivitet testning med kirurgisk exemplar av hjärntumörer, kallas "tumör Explantation metod". Med denna metod kan vi utvärdera läkemedlets effektivitet utan att bryta mikromiljön av solida tumörer. För att validera tillförlitligheten av denna metod, beskriver vi representativa uppgifter med våra gliom provet behandlas med dagens första linjens kemoterapibehandling, temozolomid.
Abstract
Den nuvarande terapier för maligna gliom har bara lindrande effekt. För terapeutisk utveckling är ett hinder skillnaden effekt bestäms av nuvarande tester läkemedlets effektivitet och effekt på patienter. Således är nya och tillförlitliga metoder för att utvärdera läkemedlets effektivitet befogat i preklinisk fas. In vitro-kultur av tumörvävnad, inklusive cellinjer, har betydande fenotypiska, genetiska och epigenetiska förändringar i cancerceller från artificiell miljö av cellodling, som återspeglar inte biologi ursprungliga tumörer på plats. Xenograft modeller med immunbrist möss har också begränsningar, det vill säga bristen på immunförsvaret och mellan arter genetiska och epigenetiska skillnader i mikromiljö. Här visar vi en ny metod med hjälp av den kirurgiska exemplar av malignt gliom som odissocierad tumörvävnad för att utvärdera behandlingseffekter. För att validera denna metod är data med den aktuella första linjens kemoterapibehandling, temozolomid (TMZ), beskrivs.
Vi använde färska avlägsnas kirurgiskt exemplar av malignt gliom för vårt experiment. Vi gjorde intratumoral injektion av TMZ eller andra kandidater drog, följt av inkubering och analys om kirurgiska preparat. Här försökte vi att etablera en tumör metod vävnad Explantation som en plattform för att fastställa effekten av nya cancerbehandlingar, så att vi kanske kan övervinnas, åtminstone vissa av de nuvarande begränsningarna och överbrygga klyftan mellan den nuvarande experimentella data och effekten på en faktisk patientens tumör. Denna metod kan ha potential att påskynda identifiera nya kemoterapeutika för fasta cancerbehandling.
Protocol
1. Beredning av medier
- Medierna var beredd att använda 10% FBS (16.140-071 - GIBCO) i DMEM/F-12 (1X), Flytande 01:01 (10.565-042 - Invitrogen) med 0,6% agar lösning Renat, Granulerad (1.01614.1000-EMD ). Sterila förhållanden bibehölls under hela försöksperioden.
- För beredning av medier 5 ml FBS (16.140-071 - GIBCO) lades till 45 ml av DMEM/F-12 (1X), Flytande 01:01 (10.565-042 - Invitrogen) gör slutlig volym om 50 ml. Den beredda media hölls i vattenbad vid 37 ° C temperatur.
- Den agar lösningen var beredd med värme mikrovågsugn metod. 0,3 gram strösocker agar upplöstes 50mL destillerat vatten med hjälp av mikrovågsugn. Den agar Lösningen blev svalna till 37 ° C temperatur genom att hålla den i vattenbad.
- Vi använde samma volym av media från steg 1,2 och 1,3 och förberett stamlösning. Förhållandet mellan 0,6% agar (0,5 mL) och 10% FBS-D-MEM/F-12 medier (0,5 mL) var 1:01, vilket gör den totala volym av 1 ml i varje brunn på 6 bra plattor.
2. Tissue bearbetning
- Glioblastoma multiforme (GBM) vävnader mottogs omedelbart efter operationen från avdelningen för patologi. Vävnaden klassificerades som GBM från Department of Pathology.
- Vävnaden överfördes till Patri-plattan med hjälp av pincetten försiktigt och tvättas med iskall 5 ml 1XPBS för 3 gånger.
- Seriell delar av prover klipptes från dissekerade prover för att skapa tumörvävnad (ungefärliga 10 mm i diameter) med ett kirurgiskt blad (Fjäder-2976 # 10) och forcep (Fisher Scientific).
- Blockerar överfördes till en 6 brunnar. Varje var väl som innehåller 1 mL av media nämner i steg 1,4. Vävnaden hade nog kontakt med luft för att hålla vävnad livskraftiga.
- Tumörvävnad var då injicerades med antingen DMSO (5%) eller TMZ (2,5 nM) och inkuberas i 16 timmar vid 37 ° C i fuktad luft som innehåller 5% CO2. 0,1 ml av DMSO (5%) eller TMZ injicerades 3 gånger i tumörvävnad på olika platser för konsekvent behandling. Den injicerades med 1 mL spruta 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Komfort punkt-26.027).
- Efter 16 timmar block spolades med 5 ml 1XPBS för 3 gånger. Efter tvättning blocken har fastställts med 10 mL 10% v / v formalin i 24 timmar (Ricca kemiföretag) i 50 ml rör (Basix-5.539.802) och behandlas paraffininbäddad 4μm sektioner.
- Formalin fast del var placerad i bägaren på rör plattan med "ingen värme" och behandlas via följande lösningar i 30 minuter i varje lösning. 30% etanol, 50% etanol, 75% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol och xylen.
- Vävnaden var torkas av på hushållspapper och placeras i smält paraffin (58 till 60 ° C, Fisher Paraplast paraffin) i 30 minuter.
- Vävnaden var inbäddad i formar med Surgipath Blue Ribbon paraffin, var inbäddad vävnad svalnat till rumstemperatur.
- Paraffininbäddade 4μm vävnadssnitt togs och placeras på Fisher Plus bilder.
3. Immunohistokemi
Immunohistokemi utfördes som beskrivits tidigare. 1
- Deparaffinization och rehydrering Placera objektglasen i ett ställ och utför följande steg. Xylen för 3x5 minuter (3 gånger under 5 minuter), 100% etanol för 3x5 minuter, 95% etanol för 1x5 minuter, 70% etanol för 1x5 minuter, skölj i rinnande kranvatten i 3 minuter.
- Antigenåtervinning med värme epitopåtervinning Doppa objektglasen i 1X citratbuffert (Thermo Scientific-AP9003-500) utspätt i destillerat vatten i ett glas bägare. Koka i 15 minuter på en värmeplatta (se avsnitt don "t ramla av bilden). Kyl lösningen i 30 minuter i rumstemperatur. Skölj objektglasen med 1X PBS för 3x5 minuter.
- Hämning av interna peroxid Doppa objektglasen i metanol (Fisher Scientific-A-452-4) med 0,3% väteperoxid (Fisher Scientific-BP2633-500-utspätt i destillerat vatten) i en glasbägare i 15 minuter. Skölj i 1X PBS för 3x5 minuter.
- Blockering Täck vävnader med 10% normal get serum. Överför bilder i en fuktig låda och inkubera i 1 timme i rumstemperatur. Tvätta objektglasen med 1X PBS för 3x5 minuter.
- Primära antikroppen § inkuberades över natten vid 4 ° C med primära antikroppen på följande koncentrationer: mänskliga specifika caspase-3 (1:1,000, FoU-system, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15.626) utspädd med 1X PBS. Skölj objektglasen i 1X PBS 3x10 minuter på följande dag.
- Sekundär antikropp reaktion Täck vävnader med 2-3 droppar HRP märkt sekundär antikropp (föreställer system). Lägg bilder i en fuktig låda och inkubera i 1 timme i rumstemperatur. Tvätta med 1X PBS för 3x10 minuter.
- Upptäckt Utveckla för kromogen DAB-kit (Vector laboratorier-SK-4100) för detektion av primär antikropp enligt tillverkarens protokollet.
- Counter färgning Sänk ned objektglasen med hematoxylin (10-15 ar econds, se Don "t överskridande DAB-signal). Skölj med rinnande vatten i 3 minuter.
- Dehydrering Sänk ned objektglasen i följande ordning, 70% etanol i 5 minuter, 95% etanol i 5 minuter, 100% etanol för 3x5 minuter, xylen i 3x5 minuter.
- Täck slip glasen med permount montering reagens (Fisher Scientific-SP-15-100).
- Bilder tagna med Olympus fluorescensmikroskop (DP-72) .3.11). I alla experiment var särskild märkning bekräftades av den negativa kontrollen utan primär antikropp.
4. Representativa resultat:
Vi samlade kirurgiska exemplar av glioblastoma multiforme (GBM). De patienter som genomgick den första operationen utan föregående kemoterapi inklusive temozolomid (TMZ). T1-viktade bilden av MRT med Gadolinium förbättring i figur-1a visar en förbättrad tumör i den högra frontalloben före operationen. Den postoperativa bilden (Figur-1b) bekräftade delsumma avlägsnande av skada efter operation. Den kirurgiska vävnader sändes till avdelningen för patologi för den kliniska diagnosen syfte, och de återstående exemplaren har bearbetats till vävnaden upphandling inom ramen för godkända Institutional Review Board (IRB) protokoll vid Ohio State University Medical Center. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning påvisat nekros, pseudopallisading celler och mikrovaskulära spridning (figur 1-C). Således var dessa tumörer histopathologically diagnosen GBM. Notera underhållas tumör explants efter inkubation utan TMZ upp till 48 timmar cytoarchitecture av GBM. I kontrast med inkubation under 72 timmar eller längre, märkte vi ett ökat antal kondenserad kärnor i proverna, vilket tyder på en del av tumörcellerna börjar genomgå apoptos. Som ett resultat innehöll tumörvävnad efter längre inkubering fläckvis regioner som förlorat tumörceller, som företrädesvis observerades vid och omkring nekrotiska områden (data visas inte).
För att undersöka om dessa tumörer Explantation prover kan säkert utnyttjas i syfte att läkemedlets effektivitet test, testade vi effekten av TMZ behandling. Figur-2 representerar flödet av experimenten i denna studie. En nyligen genomförd studie visade att intratumoral injektion av TMZ har mer potent effekt på tillväxt kontroll av malignt gliom än systemisk administrering av detta läkemedel 2. Efter inkubering i 16 timmar, var dessa explants inbäddade med paraffin och seriell sektioner var förberedda för färgning. Immunohistokemi av TMZ-behandlade GBM vävnader visade en betydande minskning av Ki-67-positiva tumörceller jämfört med kontrollprover. I sin tur gjorde immunohistokemi med en apoptos markör caspase-3, ger inte någon signifikant skillnad mellan TMZ-behandlade gliom prover och kontrollprover (Figur-3).
Behandlingseffekt med TMZ var dessutom karakteriseras genom att kombinera detta Explantation analys tillsammans med antingen in vitro-kultur eller flödescytometri. Specifikt försökte vi avgöra effekten på stamceller-liknande tumörceller (SCLTC). Därför, efter intratumoral behandling med TMZ utförde vi sfär bildar analysen och flödescytometri av dessa tumörer explants. Den TMZ-behandlade prover dissocierade i enskilda enskilda celler och dessa enskilda celler var seedade i en låg densitet (1 cell per mikroliter eller lägre) i 96-brunnar i serum-fri mediet kompletteras med bFGF och fonden. I kontrollgruppen var bildandet av tumör sfärer från tumören explants ses efter 7 dagars inkubation. Med tanke på att sfären bildas är en egenskap hos SCLTC 3 4 visar förändringar i antalet tumören områden med en läkemedelsbehandling effekten på SCLTC. Likaså var flödescytometri av dissocierade tumören explants med cellytan markör, CD133, utföras för att verifiera effekten på SCLTC. Om SCLTC i heterogena tumörceller i GBM selektivt utplånas av en läkemedelsbehandling, kan man förutsäga att flödescytometri bör upptäcka minskning av CD133-positiva bråkdel av behandlingen (data visas inte).
Fig 1 Magnetisk resonanstomografi bilder (MRT) av en patient GBM. Representativa siffror före operation Bild-1a och efter operationen Figur-1b. Figur-1c är H & E färgning av färska GBM vävnadsprov. Original förstoring, 40X.
Figur. 2 Den experimentella flödet av kvarteret kultur experiment. Figur-2a. Bild av färska kirurgiska GBM fått från institutionen för patologi. Figur-2b visar dissektion av tumör blocket till 10mm små bitar med hjälp kirurgiska bladet. Figur-2c är drogen (TMZ) behandling av tumörvävnad använder insulin spruta.
e 3 "/>
Figur. 3 Immunohistokemi. Immunohistokemi av GBM vävnad block injiceras med DMSO eller TMZ med aktivt caspase-3 och Ki67. Hematoxylin användes för nukleär färgning. Original förstoring, 40X.
Discussion
Det finns en klyfta mellan läkemedlets effektivitet i nuvarande prekliniska experimentella modeller och effekt hos patienter. Mer specifikt i hjärntumör forskningsområdet, är nya och tillförlitliga metoder krävs som skulle hjälpa att fylla den nuvarande luckan mellan drogen utvärdering med nuvarande metoder och effekt hos patienter. Den beskrivna analysen i denna studie är en extra tillgång, om inte en lösning, för att underlätta påfyllning skillnaden i experimentella data och resultatet av drabbade patienter.
In vitro cellodlingar företrädesvis utöka vissa tumörtyper cellen oberoende av odlingsbetingelser, och utgör endast en subpopulation av hela tumören. 5 Dessutom förekommer genetiska och fenotypiska omvandling av den konstgjorda cellen expansion och är oundvikligt med den långsiktiga cellkulturer . En av de stora hindren för att behandla malignt gliom är den heterogenitet tumörceller, både inom en och samma tumör och mellan tumörprover 6, 7. Därför selektiv anrikning av en viss population av tumörceller, oberoende av en typ eller en annan, kanske inte är ett lämpligt medel för att fastställa effekten av cytostatika på heterogena tumörceller. 8 9 Alla djurmodell av hjärntumörer härrör från en subpopulation av tumörceller kasta ljus på mediciners effekt på en subpopulation, men inte hela tumören.
Flera begränsningar, å andra sidan, fortfarande kvar i denna tumör Explantation metod. En sådan begränsning är den relativt korta period av behandling. Eftersom maligna tumörceller anses förvärva resistens mot de flesta, om inte alla,, behandlingar över tid kan den första kontrollen av de kortsiktiga tumörcellernas tillväxt inte återspeglas av den långsiktiga patientens prognos, var som nyligen rapporterades med en anti- angiogena agent, bevacizumab 10. Således är förbättring av protokollet för denna Explantation analys för att bevara vävnader under en längre tid krävs ytterligare undersökningar. En annan fråga är en specifik effekt av ett testat läkemedel på SCLTC i tumören. Med tanke på att SCLTC är relativt resistenta mot dagens behandlingar för maligna gliom, identifiering av nya läkemedel mot cancer som en potent utrota SCLTC är motiverad. I detta sammanhang vill vi nu att kombinera denna explantation analys med efterföljande försök in vitro, t ex neurosphere bildar analys (data visas inte). Vi förväntar oss att lära sig mer om effekterna, om några, av en läkemedelskandidat för SCLTC igenom dessa kombinerade analyser. Slutligen kan med hjälp av små block av tumörprover inte speglar hela befolkningen tumörceller, vilket är fallet med konventionella tumörcellinjer eller primära kulturer från kirurgiska preparat. Dessa frågor åt sidan, bevara Proteiners, inklusive vaskulära nisch, är till hjälp i kännetecknar miljöfaktorer för tumörceller. Därför kan denna analys har potential att utvärdera eventuella terapeutiska strategier i en mer fysiologiskt relevant tillstånd.
Här har vi etablerat test för läkemedlets effektivitet testning med explants av kirurgiska exemplar av GBM. I själva verket, med de testade kirurgiska exemplar, fann vi att en direkt injektion av TMZ minskar spridningen i GBM prover. Denna vävnad Explantation Metoden är teoretiskt gäller för andra solida cancerformer och ger tillgång att avgöra läkemedlets effektivitet på en patients tumör, som förhoppningsvis kommer att hjälpa oss att undvika ännu ett misslyckande i kliniska prövningar för cancer.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / The American Brain Tumor Association, och Khan Family Foundation för I Nakano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat-Inactivated | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| D-MEM/F-12 (1X) Liquid 1:1 | Invitrogen | 10565-042 | |
| Agar-Agar Purified, Granulated | EMD Millipore | 1.01614.1000 | |
| DPBS for staining | Invitrogen | 14190 | |
| Hematoxyllin | Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| 10% w/v formalin Caspase-3 | Ricca Chemical Company | 3810 | |
| Caspase-3 | R&D Systems | AF835 | |
| Ki67 | Dako | 15626 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Envision system- anti-mouse | Dako | 2012-07 | |
| Envision system- anti-rabbit | Dako | 2011-12 | |
| DAB-kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Table 1. Materials. | |||
| 6 Well Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Petri dish | VWR international | 25384-302 | |
| Serological pipette | Axygen Scientific | ||
| Filter tips | USA Scientific, Inc. | ||
| 500 μm polyester mesh Netwell insert | Costar | 3480 | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 354230 | |
| BD 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Hypodermic needle Aluminum Hub. | Tyco Healthcare, Covidien | 2000029 | |
| Tissue culture flask | Corning | ||
| Centrifuge tubes | Basix | 5539800 | |
| Thin wall tubes | Eton | 1107A | |
| Surgical Blade stainless steel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976#10 | |
| Insulin Syringe | Comfort point | 26027 | |
| 50mL flat top screw cap tube | Basix | 5539802 | |
| Dissection microscope | Tritech Research, Inc. | ||
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | DP-72 | |
| Forcep | Fisher Scientific | ||
| Table 2. Equipment. | |||
References
- Hemmati, H. D. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).
- Heimberger, A. B. Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats. Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).
- Nakano, I. Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells. J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).
- Laks, D. R. Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Phillips, H. S. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).
- He, J. Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation. J Proteome Res. , (2010).
- Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).
- Vik-Mo, E. O. Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions. Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).
- Hovinga, K. E. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- de Groot, J. F. Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice. Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).
