Summary
Здесь мы создали метод для тестирования на наркотики эффективности с хирургической образцов опухолей головного мозга, называемый "метод эксплантатов опухоли". С помощью этого метода мы можем оценить эффективность препарата, не нарушая микроокружение солидных опухолей. Для проверки надежности этого метода, мы описываем репрезентативные данные с нашими глиомы образца получавших текущий первой линии химиотерапевтического агента, темозоломида.
Abstract
Текущей терапии злокачественной глиомы лишь паллиативный эффект. Для лечебных развития, одним препятствием является несоответствие эффективность определяется текущей эффективность препарата испытания и эффективность на пациентах. Таким образом, новые и надежные методы оценки эффективности лекарств гарантия в доклинической фазе. В пробирке культуру опухолевых тканей, в том числе клеточных линий, имеет существенные фенотипические, генетические и эпигенетические изменения в раковых клетках, вызванных искусственным среду клеточной культуры, которая могут не соответствовать биологии оригинальной опухоли на месте. Ксенотрансплантата модели с иммунодефицитных мышей также имеют ограничения, то есть отсутствие иммунной системы и межвидовые генетические и эпигенетические различия в микроокружения. Здесь мы демонстрируем новый метод использования хирургических образцов злокачественной глиомы, как недиссоциированных блоков опухоли для оценки эффективности лечения. Для проверки этого метода, данные с текущей первой линии химиотерапевтического агента, темозоломида (ТМЗ), описаны.
Мы использовали свежих удалены хирургического образца злокачественной глиомы для наших экспериментов. Мы провели внутриопухолевые инъекции ТМЗ или других лекарств-кандидатов, с последующей инкубацией и анализ хирургических образцов. Здесь мы стремились установить опухоли методом эксплантатов ткани в качестве платформы для определения эффективности новых противораковых терапии, так что мы сможем преодолеть, по крайней мере, некоторые из существующих ограничений и заполнить существующий разрыв между текущим экспериментальным данных и эффективность на опухолевые фактического пациента. Этот метод, возможно, может ускорить выявление новых химиотерапевтических препаратов для твердых лечения рака.
Protocol
1. Подготовка средств массовой информации
- Средств массовой информации был подготовлен с использованием 10% FBS (16140-071 - GIBCO) в DMEM/F-12 (1X), Liquid 1:1 (10565-042 - Invitrogen) с 0,6% агар решение очищенная, гранулированный (1.01614.1000-EMD ). Стерильные условия сохраняется в течение всего эксперимента.
- Для подготовки медиа 5 мл FBS (16140-071 - GIBCO) добавляют к 45 мл из DMEM/F-12 (1X), Liquid 1:1 (10565-042 - Invitrogen), что делает конечный объем 50 мл. Подготовлены СМИ держали в водяной бане при температуре 37 ° С температура.
- Агар решения был подготовлен с использованием тепла методом микроволновой печи. 0,3 г гранулированного агара растворяют в 50 мл дистиллированной воды с помощью микроволновой печи. Агар раствор охладить до 37 ° С температура, держа его на водяной бане.
- Мы использовали равного объема средств массовой информации, начиная с шага 1.2 и 1.3 и приготовленный раствор акций. Отношение 0,6% агар (0,5 мл) и 10% FBS-D-MEM/F-12 СМИ (0,5 мл) был 1:1, сделав общий объем 1 мл в каждую лунку 6 хорошо пластин.
2. Ткань обработки
- Глиобластома мультиформная (GBM) тканей были получены сразу после операции из Отделение патологии. Ткань была классифицирована как GBM от Отделение патологии.
- Ткани был переведен в Патри-пластины с использованием щипцов тщательно и промывают ледяной 1XPBS 5 мл 3 раза.
- Последовательные разделы образцы были вырезаны из расчлененный образцов опухоли для создания блоков (приблизительно 10 мм в диаметре) с хирургической клинка (перо-2976 № 10) и forcep (Fisher Scientific).
- Блоки были переданы в 6-луночный планшет. Каждая скважина содержащих 1 мл СМИ упоминать в пункте 1.4. Ткани хватило выдержки на воздухе держать ткани жизнеспособной.
- Опухоль блоки затем вводят либо с ДМСО (5%) или TMZ (2,5 нм) и инкубировали в течение 16 часов при 37 ° С в увлажненный воздух, содержащий 5% СО2. 0,1 мл ДМСО (5%) или ТМЗ вводился 3 раза в опухолевых блоков в разных местах для последовательного лечения. Препарат вводят использованием инсулиновый шприц 1 мл 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Комфорт точка-26027).
- После 16 часов блоки промывали 5 мл 1XPBS в 3 раза. После мытья блоки были зафиксированы с 10 мл 10% об. / формалине в течение 24 часов (Рикка химической компании) в 50 мл пробирок (Basix-5539802) и обрабатываемых в парафин 4μm разделов.
- Фиксированных формалином и раздел был помещен в стакан на мешалки "БЕЗ ТЕПЛА" и обработаны с помощью следующих растворов в течение 30 минут в каждом решении. 30% этанола, 50% этанола, 75% этанола, 80% этанола, 95% этанола, 100% этанола и ксилола.
- Ткань уничтожены на бумажных полотенцах и помещен в расплавленный парафин (58 до 60 ° С, Фишер Paraplast парафин) в течение 30 минут.
- Тканей было заложено в форм использования Surgipath Blue Ribbon парафин, встроенные ткани охлаждали до комнатной температуры.
- Парафин 4μm разделах ткани были приняты и помещены на слайдах Фишер Plus.
3. Иммуногистохимия
Immunohistochemistry проводили, как описано выше 1.
- Депарафинизации и регидратации Место слайдов в стойку и выполнять следующие действия. Ксилол для 3x5 минут (3 раза по 5 минут), 100% этанола для 3x5 минут, 95% этанола для 1x5 минут, 70% этанола для 1x5 минут, промыть в проточной воде в течение 3 минут.
- Антиген поиска теплом индуцированных эпитопа поиска слайды Погрузитесь в 1X буфера цитрата (Thermo научно-AP9003-500) разводят в дистиллированной воде в стеклянном стакане. Кипятить 15 минут на горячей плите (убедитесь, что разделы дона "т упасть слайд). Прохладный решение в течение 30 минут при комнатной температуре. Промыть слайды с 1X PBS для 3x5 минут.
- Подавление внутренней перекиси Погрузите слайды в метаноле (Fisher Scientific-A-452-4) с 0,3% перекиси водорода (Fisher Scientific-BP2633-500-разводят в дистиллированной воде) в стеклянный стакан на 15 минут. Полоскание в 1X PBS для 3x5 минут.
- Блокировка крышки ткани с 10% нормальной козьей сывороткой. Передача слайдов в поле влажное и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте слайды с 1X PBS для 3x5 минут.
- Первичные разделы антитела инкубировали в течение ночи при температуре 4 ° C с первичными антителами в следующих концентрациях: человеческий конкретных каспазы-3 (1:1000, R & D Systems, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) разбавляют 1X PBS. Промыть слайдов в 1X PBS 3х10 минут на следующий день.
- Вторичные реакции антител Обложка ткани с 2-3 каплями HRP меченых вторичных антител (представить себе системы). Положите слайды в влажном поле и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть 1X PBS для 3x10 минут.
- Обнаружение Разработка для хромогена DAB комплект (Vector лабораторий-SK-4100) для выявления первичного антитела следующий протокол производителя.
- Счетчик окрашивания Погрузите слайды гематоксилином (10-15 сек econds, убедитесь, что дон "т перерасход DAB сигнал). Промыть струей воды в течение 3 минут.
- Обезвоживание Погрузите слайдов в следующем порядке: 70% этанолом в течение 5 минут, 95% этанола в течение 5 минут, 100% этанола для 3x5 минут, Ксилол для 3x5 минут.
- Обложка скольжения слайды с permount монтажа реагента (Fisher Scientific-SP-15-100).
- Изображения выполнены при помощи флуоресцентного микроскопа Olympus (DP-72) .3.11). Во всех экспериментах, конкретные маркировки была подтверждена отрицательного контроля без первичных антител.
4. Представитель Результаты:
Мы собрали хирургических образцов глиобластомы мультиформная (GBM). Больным первой операции без предварительной химиотерапии в том числе темозоломида (ТМЗ). Т1-взвешенные изображения МРТ с гадолинием на рисунке 1а продемонстрировали расширение опухоль в правой лобной доли до операции. Послеоперационные изображение (рис.-1b) подтвердил Итого удаление поражения после операции. Хирургических ткани были отправлены в отделении патологии для клинических целей диагностики, а остальные образцы были обработаны, чтобы ткань закупок в рамках утвержденного совета организации (IRB) протокол в Университете штата Огайо медицинский центр. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивания свидетельствует о присутствии в некроз, pseudopallisading клеток, и микрососудистых распространения (рис. 1-в). Таким образом, эти опухоли были диагностированы как гистопатологически GBM. Следует отметить, что опухоль эксплантаты после инкубации без ТМЗ до 48 часов поддерживается cytoarchitecture из GBM. Напротив, с инкубацией в течение 72 часов или более, мы заметили увеличение числа конденсированных ядер в образцах, предполагая, некоторые опухолевые клетки начинают подвергаются апоптозу. В результате опухолевой ткани следующие больше инкубационный содержащихся пятнистый регионов, которые потеряли опухолевые клетки, которые были преимущественно наблюдается и вокруг некротических областей (данные не приведены).
Для того чтобы исследовать, если эти образцы опухоли эксплантов могут быть эффективно использованы для целей допинг-контроль эффективности, мы протестировали эффект лечения ТМЗ. Рис-2 представляет поток эксперименты в этом исследовании. Недавнее исследование показало, что внутриопухолевые инъекции ТМЗ имеет более мощное влияние на контроль роста злокачественной глиомы, чем системное введение этого препарата 2. После инкубации в течение 16 часов, эти эксплантов были встроены с парафином и серийных срезов были готовы к окрашиванию. Immunohistochemistry из ТМЗ обработанной ткани GBM продемонстрировали существенное снижение Ki-67-положительных клеток опухоли по сравнению с контрольными образцами. В свою очередь, иммуногистохимии с апоптозом маркер, каспазы-3, не дали никаких существенных различий между ТМЗ обработанных глиомы образцов и контрольных образцов (рис.-3).
Эффект лечения с ТМЗ было дополнительно характеризуется, комбинируя эту эксплантов анализа вместе с ни в пробирке культуру или проточной цитометрии. В частности, мы попытались определить, влияет на стволовые клетки, как опухолевые клетки (SCLTC). Поэтому, следуя внутриопухолевые лечения ТМЗ, мы провели сфере формирования анализа и проточной цитометрии этих опухолей эксплантов. TMZ обработанные образцы распадается на отдельные единичные клетки и эти отдельные клетки высевают в низкой плотности (1 клетка на микролитр или ниже), в 96-луночных планшетах в свободной от сыворотки среде с bFGF и ЭФР. В контрольной группе, формирование опухоли сфер от опухоли эксплантатах наблюдалось после 7 дней инкубации. Учитывая, что сфера образования является собственностью SCLTC 3 4, изменения в количество опухолевых сфер наркологических указывает влияние на SCLTC. Кроме того, проточной цитометрии диссоциированных эксплантов опухоли с маркером на поверхности клеток, CD133, было проведено для проверки воздействия на SCLTC. Если SCLTC в гетерогенных опухолевых клеток в GBM избирательно уничтожить, медикаментозное лечение, можно было бы предсказать, что проточная цитометрия должен обнаружить снижение CD133-позитивных фракции лечения (данные не приведены).
Рис.1 Магнитно-резонансных изображений (МРТ) пациентов GBM. Представителю фигуры предэксплуатационный Рис-1а и после операции Рис-1b. Рис-1C H & E окрашивание свежий образец ткани GBM. Оригинальные увеличение, 40Х.
Рис. 2 экспериментальных поток блок эксперимент культуры. Рис-2а. Изображение свежих хирургических GBM, полученных от отдела патологии. Рис-2b показывает Препарирование опухоли блока в 10мм мелкие кусочки с помощью хирургического ножа. Рис-2с является препаратом (ТМЗ) лечение опухоли блоки, используя инсулиновый шприц.
E 3 "/>
Рис. 3 иммуногистохимии. Immunohistochemistry из GBM блоков ткани вводили ДМСО или ТМЗ с активированной каспазы-3 и Ki67. Гематоксилин был использован для ядерной окрашивания. Оригинальные увеличение, 40Х.
Discussion
Существует разрыв между эффективность препарата в текущем доклинических экспериментальных моделях и эффективность у пациентов. В частности, в области исследования опухоли головного мозга, новые и надежные методы необходимы, которая помогла бы заполнить существующий разрыв между наркотиками оценки с существующими методами и эффективность у пациентов. Анализ описанных в данном исследовании, является дополнительным активом, если не решение, чтобы облегчить заполнение несоответствие экспериментальных данных и результатов больных.
В культурах пробирке ячейки преимущественно расширить некоторые типы опухолевых клеток независимо от условий культивирования, и представляют собой лишь субпопуляции всю опухоль. 5 Кроме того, генетические и фенотипические преобразовании искусственного расширения ячейки происходит и неизбежно при долгосрочных культурах клеток . Одним из основных препятствий для лечения злокачественной глиомы является неоднородность опухолевых клеток, как в одной опухоли, а также между образцов опухоли 6, 7. Таким образом, селективное обогащение определенной популяции опухолевых клеток, вне зависимости от того или иного типа, не могут быть соответствующие средства, чтобы определить эффективность любых химиотерапевтических агентов на гетерогенных опухолевых клеток. 8 9 Любое животное модель опухоли головного мозга происходит от субпопуляции опухолевые клетки пролить свет на эффективность препарата субпопуляции, но не всю опухоль.
Некоторые ограничения, с другой стороны, все еще остаются в этой опухоли методом эксплантов. Одним из таких ограничений является относительно короткий период лечения. Поскольку злокачественные опухолевые клетки считаются приобретают устойчивость к большинству, если не все, терапии с течением времени, входного контроля краткосрочного роста опухолевых клеток, возможно, не отражает долгосрочный прогноз пациента, как это было недавно сообщили, с анти- ангиогенных агента, бевацизумаб 10. Таким образом, улучшение протокола для этого эксплантов анализа сохранить ткани в течение длительного времени требуется в дальнейших исследованиях. Другой вопрос заключается в специфическом действии испытания препарата на SCLTC в опухоли. Учитывая, что SCLTC относительно устойчивы к текущей терапии злокачественной глиомы, выявление новых противораковых препаратов, которые мощно искоренению SCLTC является оправданным. В этой связи мы в настоящее время стремятся объединить эту эксплантов анализа с последующим в пробирке эксперименты, такие как neurosphere формирования анализа (данные не приведены). Мы ожидаем, чтобы узнать больше о эффектами, если таковые имеются, наркотиков кандидат на SCLTC через эти объединенные анализов. Наконец, с помощью небольших блоков образцов опухоли могут не отражать всего населения опухолевых клеток, как и в случае с обычными опухолевых клеток линий или первичных культур из хирургических образцов. Эти вопросы в сторону, сохраняя опухоли стромы, в том числе сосудистых нишу, полезно для характеристики экологических факторов на клетки опухоли. Таким образом, этот анализ может иметь потенциал для оценки любого терапевтических стратегий в рамках более физиологически соответствующие условия.
Здесь мы создали тест для тестирования эффективности препарата с эксплантов хирургических образцов GBM. На самом деле, с тестируемым хирургических образцов, мы обнаружили, что непосредственным впрыском ТМЗ уменьшает распространение в GBM образцов. Этот метод ткани эксплантов теоретически применимы и к другим солидным раком и обеспечивает активов, чтобы определить эффективность препарата на опухолевые пациента, который, мы надеемся, поможет нам избежать очередного провала клинических испытаний для рака.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Американское онкологическое общество (MRSG-08-108-01), Винсент Дж. Сгро / Американской ассоциации опухоли головного мозга, и семьи Хана, ибо я Накано.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat-Inactivated | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| D-MEM/F-12 (1X) Liquid 1:1 | Invitrogen | 10565-042 | |
| Agar-Agar Purified, Granulated | EMD Millipore | 1.01614.1000 | |
| DPBS for staining | Invitrogen | 14190 | |
| Hematoxyllin | Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| 10% w/v formalin Caspase-3 | Ricca Chemical Company | 3810 | |
| Caspase-3 | R&D Systems | AF835 | |
| Ki67 | Dako | 15626 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Envision system- anti-mouse | Dako | 2012-07 | |
| Envision system- anti-rabbit | Dako | 2011-12 | |
| DAB-kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Table 1. Materials. | |||
| 6 Well Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Petri dish | VWR international | 25384-302 | |
| Serological pipette | Axygen Scientific | ||
| Filter tips | USA Scientific, Inc. | ||
| 500 μm polyester mesh Netwell insert | Costar | 3480 | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 354230 | |
| BD 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Hypodermic needle Aluminum Hub. | Tyco Healthcare, Covidien | 2000029 | |
| Tissue culture flask | Corning | ||
| Centrifuge tubes | Basix | 5539800 | |
| Thin wall tubes | Eton | 1107A | |
| Surgical Blade stainless steel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976#10 | |
| Insulin Syringe | Comfort point | 26027 | |
| 50mL flat top screw cap tube | Basix | 5539802 | |
| Dissection microscope | Tritech Research, Inc. | ||
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | DP-72 | |
| Forcep | Fisher Scientific | ||
| Table 2. Equipment. | |||
References
- Hemmati, H. D. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).
- Heimberger, A. B. Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats. Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).
- Nakano, I. Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells. J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).
- Laks, D. R. Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Phillips, H. S. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).
- He, J. Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation. J Proteome Res. , (2010).
- Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).
- Vik-Mo, E. O. Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions. Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).
- Hovinga, K. E. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- de Groot, J. F. Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice. Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).
