Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.
염색체 분리의 실수 aneuploid 세포를 얻으실 수 있습니다. 체세포에서 aneuploidy가 암 관련지만 gametes에서 aneuploidy가 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애로 연결됩니다. Haploid gametes는 감수 분열에 결합 아르 종의 특정 개발 프로그램을 통해 양식. 상동 염색체가 시위하는 동안 자매 chromatids가 연결되어 남아 있기 때문에 첫 번째 meiotic 사업부 (MI)는 감수 분열에 고유한 것입니다. 완전히 이해하지상의 이유로,이 reductional 부문에서 오류가하는 경향이 있으며, 더 일반적으로 세포의 감수 분열 II (미이)에 오류가 이상하거나 남성 감수 분열 1,2에서 오류보다 aneuploidy의 원천입니다.
포유 동물에서는, 대형, 손상 본원 소포 (GV; 핵)과 MI의 prophase에서 oocytes의 체포와 그들이 ovulatory 신호를받을 경우에만 감수 분열을 재개. 일단 세포의 감수 분열의 이력서, oocytes 전체 MI 및 미이의 metaphase에서 다시 체포, 비대칭 세포 분열을 받다. 그들이 정자에 의해 수정된 때까지 계란은 미이를 작성하지 않습니다. Oocytes 또한 체외 배양 조건 3 설립된 사용 meiotic 성숙을 받다 수 있습니다. 유전자 변형과 유전자 타겟 마우스 돌연변이의 생성은 비용이고 오랜 기간 걸릴 수 있기 때문에, 체외에서 여성 gametes의 조작보다 경제적이고 시간을 절약할 전략이다.
여기, 우리는 생쥐로부터 microinjection을 위해 prophase – 체포 oocytes을 분리하는 방법을 설명합니다. 선택의 모든 자료는 oocyte에 소개 될 수 있지만, meiotically – 관할 oocytes은 4,5 cRNA, 그리고 DNA transcriptionally 침묵 때문에, 이소성 표현 연구 주입해야합니다. ploidy 평가하기 위해, 우리는 미이 달걀 oocytes의 체외의 성숙에 대한 우리의 조건을 설명합니다. 역사적으로, 염색체 – 확산 기술은 염색체 번호 6 카운트에 사용됩니다. 이 방법은 기술적으로 도전하고 오직 hyperploidies을 식별로 제한됩니다. 여기서 우리는 하이포과 7-8 그대로 계란을 사용하여 hyperploidies을 결정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 monastrol 개인 kinetochores가 쉽게 안티 – 크레스트 면역 혈청을 사용하여 검색하고 집계 수 9 있으므로 염색체 분리와 같은 monopolar 스핀들에 바이폴라 스핀들을 붕괴 kinesin – 5 억제제를 사용합니다. 이 메서드가 그대로 계란에서 수행되기 때문에, 염색체는 운영자 오류로 인해 손실되지 않습니다.
oocytes의 Microinjection은 meiotic 성숙 10,11, 12, 13을 조절 메커니즘을 연구하기위한 강력한 방법입니다. 이 방법은 유전자 변형과 타겟이 마우스 모델을 개발에 큰 투자를 만들기 전에 가설을 테스트하는 경제적인 방법을 제공합니다. Oocyte 수집 및 microinjection 기술은 전형적인 세포 생물학 절차보다 주인에게 더 많은 시간을 필요로합니다. 컬렉션 특정 장애는 종종 수집에 대한 적절한 크기의 유리 피펫을 당기와 체세포의 스트립과 oocytes는 인큐베이터 외부되는 시간을 최소화하기 위해 수집 속도를 증가, 입 피펫을 통제 있습니다. 우리는 실험을하기 전에 여러 번 연습하는 것이 좋습니다. 세포의 같은 번호를 유지하면서 microdrops 사이 oocytes를 전송하면이 방법으로 편안한 될 수있는 좋은 방법입니다.
microinjection을 배우면서 세포 죽음은 일반적으로 발생합니다. 이것은 oocyte의 반대편을 날카로운 주사 바늘로 핵을 치면 소재의 볼륨 (사출 바늘 자리가 너무 큽니다 IE)의 너무 큰의 분사를 포함한 여러 가지 이유로,,, 또는 해당 발생할 수 있습니다 주입 재료 oocyte에 유해합니다. 당신의 생존 비율이 50 % 이상까지 oocytes로 버퍼를 주사와 함께 연습하는 것은이 기술을 마스터하는 열쇠입니다. oocytes가 성숙하지 않으면 그것은 milrinone 충분히 희석되지 않은 것입니다. 우리는 성숙하기 전에 milrinone 무료 CZB 많은 큰 방울을 통해 oocytes를 rinsing 것이 좋습니다.
ploidy 분석 다음의 microinjection은 meiotic 성숙을 평가하기 위해 많은 assays 중 하나입니다. 우리가 실험실에서 사용하는 다른 루틴을 분석하는 스핀들 형성과 염색체 정렬 계란 활성화를 분석하거나 체외의 수정에 oocyte 조작 14,15의 발달 결과, 16을 평가하기 위해 immunofluorescence 감수 분열을 통해 oocytes 진행, 반응 속도론 모니터링을 포함 17.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 리차드 M. 슐츠의 연구실에서 수행되었다. 저자는 또한 centromere – 카운팅 분석과 그의 공촛점 현미경에 대한 액세스를 conceptualizing에 대한 마이클 램프슨을 인정하고 싶습니다. 테레사 치앙과 프란체스카 던컨 centromere – 카운팅 분석을 최적화에 도움. 폴라 스테인은 HD022681에서 지원 (RMS로)와 카렌 쉰들러는 HD055822에 의해 지원됩니다.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |