Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.
Erreurs dans la ségrégation des chromosomes conduire à des cellules aneuploïdes. Dans les cellules somatiques, l'aneuploïdie est associée au cancer, mais dans les gamètes, conduit à une aneuploïdie infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Gamètes haploïdes forme à travers des espèces spécifiques à des programmes de développement qui sont couplés à la méiose. La première division méiotique (MI) est unique à la méiose parce chromatides sœurs restent attachés tout chromosomes homologues sont séparés. Pour des raisons encore mal comprises, cette division réductionnelle est sujette à des erreurs et est plus communément la source de l'aneuploïdie que les erreurs de la méiose II (MII) ou que les erreurs dans le 1,2 méiose mâle.
Chez les mammifères, l'arrestation des ovocytes à la prophase de la MI avec un grand vésicule germinale intacte (GV; noyau) et ne reprendra la méiose quand ils reçoivent des signaux ovulatoire. Reprend la méiose fois, MI ovocytes complet et subir une division cellulaire asymétrique, en arrêtant à nouveau à la métaphase des MII. Oeufs ne sera pas complète MII jusqu'à ce qu'ils soient fertilisés par le sperme. Les ovocytes peuvent également subir une maturation méiotique à l'aide établie dans des conditions de culture in vitro 3. Parce que la génération de mutants de souris transgéniques et le gène ciblé est coûteuse et peut prendre de longues périodes de temps, la manipulation des gamètes femelles in vitro est une stratégie plus économique et gain de temps.
Ici, nous décrivons les méthodes pour isoler prophase arrêté ovocytes de souris et pour la microinjection. Tout matériau de choix peut être introduit dans l'ovocyte, mais parce méiose-compétents ovocytes sont transcriptionnellement silencieux ARNc 4,5, et non de l'ADN, doit être injecté pour les études de l'expression ectopique. Pour évaluer la ploïdie, nous décrivons nos conditions pour la maturation in vitro des ovocytes MII aux œufs. Historiquement, les techniques d'épandage du chromosome sont utilisés pour le comptage de 6 le nombre de chromosomes. Cette méthode est techniquement difficile et est limitée à seulement identifier hyperploidies. Ici, nous décrivons une méthode pour déterminer hypo-et hyperploidies utilisant des oeufs intacts 7-8. Cette méthode utilise monastrol, un inhibiteur de la kinésine-5, qui s'effondre fuseau bipolaire dans un fuseau monopolaire 9 chromosomes séparant ainsi de telle sorte que kinétochores individuels peuvent être facilement détectées et comptées en utilisant un sérum anti-CREST auto-immunes. Parce que cette méthode est réalisée dans des oeufs intacts, les chromosomes ne sont pas perdues en raison d'une erreur de l'opérateur.
Microinjection d'ovocytes est une méthode puissante pour étudier les mécanismes qui régulent la maturation méiotique 10,11, 12, 13. Cette méthode offre un moyen économique pour tester les hypothèses avant de faire un investissement important dans le développement de modèles de souris transgéniques et ciblée. La collecte des ovocytes et des techniques de micro-injection nécessitent plus de temps à maîtriser que les procédures typiques de biologie cellulaire. Obstacles spécifiques à la collecte comprennent souvent le contrôle de la pipeter à la bouche, tirer la pipette en verre taille appropriée pour la collecte et le décapage des cellules somatiques et augmente la vitesse de collecte afin de minimiser le temps pendant lequel les ovocytes sont en dehors de l'incubateur. Nous vous recommandons de pratiquer plusieurs fois avant de faire des expériences. Transfert entre les ovocytes microgouttes tout en conservant le même nombre de cellules est une excellente façon de se familiariser avec cette méthode.
La mort cellulaire survient fréquemment, tout en apprenant la microinjection. Cela pourrait se produire pour un certain nombre de raisons, y compris l'injection d'un trop grand d'un volume de matière (c'est à dire l'ouverture de l'aiguille d'injection est trop grand), frapper le noyau avec l'aiguille d'injection, perçant le côté opposé de l'ovocyte ou que le matériau injecté est toxique pour l'ovocyte. Pratiquer avec injection de tampon dans des ovocytes jusqu'à ce que votre taux de survie est d'au moins 50% est la clé pour maîtriser cette technique. Si ovocytes ne parviennent pas à maturité, il est probable que la milrinone n'a pas été diluée suffit. Nous recommandons de rincer à travers de nombreux ovocytes de grosses gouttes de milrinone sans CZB avant la maturation.
L'analyse de la micro-injection ploïdie dessous un des nombreux tests pour évaluer la maturation méiotique. Autres analyses de routine que nous utilisons dans le laboratoire incluent la surveillance de la cinétique par lequel le progrès à travers la méiose des ovocytes, l'immunofluorescence pour analyser la formation du fuseau et l'alignement des chromosomes et l'activation d'oeuf ou de fécondation in vitro pour évaluer les conséquences du développement de la manipulation des ovocytes 14,15, 16, 17.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été effectué dans le laboratoire de Richard M. Schultz. Les auteurs tiennent également à remercier Michael Lampson pour conceptualiser le dosage centromère comptage et l'accès à son microscope confocal. Teresa Chiang et Francesca Duncan a aidé à optimiser le dosage centromère comptage. Paula Stein est soutenu par HD022681 (RMS) et Karen Schindler est soutenu par HD055822.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |