Summary
Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.
Abstract
Kromozom segregasyon hatalar anöploid hücrelere yol. Somatik hücre, anöploidi kanseri ile ilişkili ama gamet, anöploidi Down sendromu gibi kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar yol açar. Haploid gametlerin mayoz bölünme ile birleştiğinde türe özgü gelişim programları aracılığıyla oluşturur. Kromozomlar ayrı, kardeş kromatidler bağlı kalır çünkü ilk mayoz bölünme (MI) mayoz için eşsizdir. Reductional bölümü tam olarak anlaşılamamış nedenlerden dolayı, bu hataları eğilimli ve daha yaygın hataları daha mayoz II (MII) ya da erkek mayoz 1,2 hataları daha anöploidi kaynağıdır .
Memelilerde, büyük, sağlam germinal vezikül (GV; nükleus) profaz MI oosit tutuklama ve ovulatuar ipuçları aldığınızda sadece mayoz devam. Bir kez mayoz bölünme devam eder, oosit tam MI ve MII, metafaz tekrar yakalama, asimetrik hücre bölünmesi tabi. Yumurta, sperm tarafından döllenmiş kadar MII tamamlayacak. Oosit in vitro kültür koşullarında 3 kurulan mayotik olgunlaşma tabi. Ve gen-hedefli transgenik fare mutantlar üretimi pahalı ve uzun süre alabilir, çünkü in vitro dişi gamet manipülasyonu daha ekonomik ve zaman tasarrufu sağlayan bir stratejidir.
Burada, fareler ve mikroenjeksiyon için profaz-tutuklandı oosit izole etmek için yöntemler açıklanmaktadır. Herhangi bir malzeme tercih oosit içine tanıtıldı olabilir, ama yetkili meiotically-oosit 4,5 Crna değil, DNA transkripsiyonel sessiz çünkü, ektopik ifade çalışmaları için enjekte edilmelidir. Ploidi değerlendirmek için, MII yumurta oositlerin in vitro olgunlaşma için koşulların tanımlanması. Tarihsel, kromozom yayılan teknikleri, kromozom sayısı 6 saymak için kullanılır . Bu yöntem teknik olarak zordur ve sadece hyperploidies belirlenmesi amacıyla sınırlıdır. Burada, hipo-ve sağlam yumurta 7-8 kullanarak hyperploidies belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bipolar, iğsi 9 böylece ayıran kromozom bireysel eski haline döner, anti-CREST otoimmün serum kullanılarak kolayca algılanır ve sayılacaktır ki bir monopolar mili içine çöker kinesin-5 inhibitörü, monastrol kullanır . Çünkü bu yöntem sağlam yumurta, kromozomlar, operatör hatası nedeniyle kaybolmuş değildir.
Protocol
1. Fare oosit toplama
- Her fare izole antral folikül sayısını en üst düzeye çıkarmak için, intraperitoneal 5 IU gebe kısrak serum gonadotropini (PMSG) ile cinsel olgun dişi fareler enjekte (Harlan 6 haftalık CF-1 fareler).
- 2.5 mcM milrinon ekleyerek toplama orta (MEM / PVP) (3 ml / fare) hazırlayın ve 37 sıcak ° C Milrinon oosit folikülleri çıkarılır kez mayotik tutuklama sağlayan bir fosfodiesteraz inhibitörüdür. Alternatif olarak, 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) (0.2 mM) veya dibutyryl siklik adenozin monofosfat (dbcAMP) (100 mg / ml) kullanılabilir. Glutamin (1 mM) ve milrinon (2.5 mcM), CZB 1 ml ekleyerek kültür ortamı hazırlayın ve en az bir saat için inkübatör gelmesini sağlayınız. Mineral yağ ile bir Petri kabı ve bindirme her microdrops ayarlayın. MEM / PVP çanak sıcak bir slayt dışında kalırken CZB çanak kuvöz içine yerleştirilir. (Özel ortam veya Sigma M2 ve M16) piyasada bulunan diğer toplama ve kültür ortamı, aynı zamanda düzenli olarak kullanılıyor.
- Emişli PMSG Yaklaşık 48 saat sonra, CO 2 sedasyon servikal dislokasyon kullanarak fare kurban, yumurtalıkların incelemek ve önceden ısıtılmış MEM / PVP + milrinon (MEM / PVP + M) içeren bir Dürbün içine yerleştirin.
- 1 ml insülin şırınga kullanarak, çanak yumurtalıkların çapa ve 27 gauge (veya dikiş) birbirine bağlanmış iğneler ile birkaç kez delinmesiyle antral foliküller bırakın.
- Diseksiyon mikroskobu ile bakarken, ağız çalışan cam pipet kullanarak cumulus-oosit kompleksleri toplamak. Mikroskop kontrast çok yararlı olur. Alternatif olarak, doku ve hücreler içeren orta, bir plastik Petri kabı bir kapak pipetlenir olabilir. Sadece büyük antral foliküller ve küçük pre-antral folikülleri veya arındırılır oosit toplamak. Bir kez toplanan, sıcak slayt ve yağ altında MEM / PVP + M microdrop kompleksleri aktarın.
- Küçük bir pipet kullanarak (oosit çapı biraz daha büyük) kompleksleri, kümülüs hücreleri ayırmak için pipet ve aşağı yukarı. Daha büyük bir CZB + milrinon (CZB + M) microdrop içine bir pipet ve inkübatör yer ile arındırılır oosit transfer.
- Oosit manipülasyona inkübatör en az 1 saat önce kurtarmak için izin verin.
2. Oosit mikroenjeksiyon
- Mekanik bir çektirmenin borosilikat cam kapiller tüp çekerek enjeksiyon pipetler olun. P = 500, Isı = 300, çekin = 150, Vel = 100, Zaman = 150: Biz aşağıdaki ayarları ile Flaming-Brown mikropipet çektirmesi (Model P-97) kullanın.
- 1-iyi bir odasına slayt seçim enjeksiyon malzemesi 0.5 ul damla (örneğin siRNA, Crna, morfolino oligonükleotid, vb) mümkün olduğunca yakın, MEM / PVP + M 5 ul damlatılarak mikroenjeksiyon platformu hazırlayın medya odası kaldırdı. Mineral yağ ve mikroskop sahnede yer (Şekil 1) ile kaplayın.
- MEM / PVP + M. düşüş içine sahipleri ve pozisyon içine yerleştirin enjeksiyon ve tutma pipetler Picoinjector ve anti-vibrasyon masa bağlı nitrojen tankları açın. Orta ile doldururken holding pipet karşı hafifçe dokunarak enjeksiyon pipet ucu açın. Açılması çok büyükse, orta hızlı ve dışarı hareket edecek ve iğne hücre öldürecek. Çok küçük bir açılış ile Pipetler kolaylıkla tıkar.
- Platform üzerinde MEM / PVP + M damla inkübatör transfer oosit (5-10). Enjekte önce picoinjector kurulum. PBal = 2.5-3.5 psi, PInj = 7.8 psi, PClear = 10-12 psi, zaman = 3s: Biz bizim picoinjector (Model PLI-100 Harvard Apparatus) aşağıdaki parametreleri kullanın. Bu sonuçlar bir enjeksiyon hacmi 5-10 pL.
- Temiz basarken, malzeme düşmesi, bir iğne taşımak ve dolgu. Orta damlasına kadar dönün.
- Bir oosit yakalama ve x-ekseni boyunca enjeksiyon iğnesi, oosit ve pipet tutan hizalamak için holding pipet kullanın.
- Yüksek büyütme altında, çekirdeğin önlemek için dikkatli olmak oosit yoluyla enjeksiyon pipet ilerlemek. Plazma zarı delinir sonra, ENJEKTE basın. Enjeksiyondan sonra iğne geri çekin. Oosit ve tekrar bırakın. Bir kez tüm oosit enjekte edilir, inkübatör dönün. Zaman istenilen miktarda CZB + M tutun; bu kez deneysel amacı (yani siRNA ve morfolino demonte (24 saat), aşırı ekspresyonu (3-12 saat)) bağlıdır. Lütfen 24 saat daha uzun inkubasyon mayotik olgunlaşma tehlikeye dikkat.
3. Oosit olgunlaşma
- Inkübasyon CZB birkaç damla (olgunlaşma orta) ile oosit yıkayın ve inkübatör petrol ve yer altında olgunlaşması orta microdrop transferinden sonra.
- 16 saat tam olgunlaşma t için izin ver o mayoz II metafaz.
4. Ploidi analizi
- CZB + monastrol (100 mcM) yeri ve dış halka su olan bir organ kültürü çanağı kuyuya 750 ul hazırlayın.
- Yumurta, CZB + monastrol birkaç damla ile yıkayın ve organ kültürü çanak içine aktarabilirsiniz. 1 saat kuvöz koyun
- Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle PBS içinde% 2 paraformaldehid içeren bir Dürbün içine aktararak yumurta sabitleyin. Çözümü engelleme başka bir Dürbün içine aktarın. Bu yemek, işlenmiş ° C ye kadar 4 saklanabilir.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir Dürbün permeabilization solüsyonu (PBS +% 0.3 BSA +% 0.1 TritonX-100 +% 0.02 NaN 3) aktarın. Çözümü engelleme birkaç geniş hacimli ile durulayın (PBS +% 0.3 BSA + 0.01 Tween 20 +% 0.02 NaN 3).
- Prosedürün geri kalan kısmı, oda sıcaklığında, ışıktan korumalı nemlendirilmiş bir odasında bir 96 plaka kapağı yapılır. Damla (~ 25 ul) dairesel girintileri içinde yerleştirilir. 15 dakika boyunca çözüm engelleme yumurta transferi.
- Etiket sentromerlere, 01:40 anti-serum CREST içeren engelleme çözümünün bir damla transfer yumurta. En az 1 saat inkübe , Her biri 15 dakika inkübe engelleme çözümünün 3 damla ile yıkayın.
- Cy5 veya Alexa-flor-594-konjuge anti-insan IgG (1:200) ve 1s inkübe içeren engelleme çözümünün bir damla yumurta transferi. Son adım dışında yukarıdaki adımları yıkama tekrarlayın, kromozom tespit etmek için engelleme çözümü Sytox Yeşil (1:5,000) içerir. Mount Vectashield 5 ul. Yumurta kırma önlemek için vazelin lamel nerede olacak köşelerinde 4 küçük noktalar koyun. Üst ve tırnak cilası ile mühür lamel yerleştirin. 4 slayt kutusunda saklayın ° C konfokal mikroskobi ile işleme kadar.
- 100X amacı ile görüntüleme iken, Z-düzlem ve görüntü metafaz mili tüm bölgenin 0.4 mikron adımları yakalamak. Resim J (NIH) gibi görüntüleme yazılımı kullanarak sentromerlere güvenin.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 2, Z-euploid bir yumurtadan bir projeksiyon. MII, metafaz, euploid fare yumurtaları 20 çift kromozom içerir ve bu nedenle 40 sentromerlere var. Bazen kromozom monastrol tedaviye rağmen yaymak için başarısız olur. Bu durum zor güvenilir sentromerlere saymak ve bu nedenle analizlerde bu yumurta içermez yapar. Bazen, bir CREST immunoreaktif "spot" 1 ya da 2 sentromerlere olup olmadığını belirlemek için zor olabilir. Kromozom yönünü dikkatle not ise biri her Z-kesit analiz, çünkü Görüntü J gibi programları kullanarak yararlı, bir "nokta" tespit edildiği bölümler ve piksel yoğunluğu "noktalar" var. Mayotik mili kutup vücudun göre konumlandırılmış bağlı olarak, DNA bölgeleri üst üste ve bu numuneler analize dahil edilmemelidir.
Unmanipulated anöploidi oranının düşük (~% 1-2), üreme genç farelerde in vivo ovulasyon yumurta var. Ancak, nedenleri anlaşılamamıştır, mikroenjeksiyon ve in vitro olgunlaşma prosedürler bu oranı yukarı% 10 artırabilir . Bu nedenle, herhangi bir mikroenjeksiyon çalışma kontrolü enjekte oosit dahil olduğu kritik öneme sahiptir.
Şekil 1. Mikroenjeksiyon çanak kurmak. Sadece enjeksiyon çözüm 0.5μl damla üzerinde MEM / PVP + M 5 ul damla odasına doğru kaydırın. Mineral yağ ile kaplayın. Bu örnekte 3, 3 farklı enjeksiyon çözümler için damla ve slayt mikroskop sahnede oturan vardır. Mikroenjeksiyon iğne ve sağa sola tutarak pipet. Iğnelikler bir yansıması olduğunu unutmayın.
Şekil 2. Ploidi sonuçları. Euploid metafaz II yumurta A dan Z ye projeksiyon. DNA yeşil renkli ve eski haline döner, kırmızı renklidir. Oklar ki eski haline döner (# 17 ve # 18) örtüşme gösteren 2 ayrı kromatid silah. Euploid fare yumurtaları kinetochore 20 çift (toplam 40 "noktalar") içerir. Anöploid yumurta bu sayı üzerinde herhangi bir değişiklik içerir. Bu yordamı metafaz MI oosit yapılmış olsaydı, 40 kinetochore çift (toplam 80 "noktalar") olmazdı.
Tablo 1. Reçete toplama ve mikroenjeksiyon orta için (MEM / PVP + M). Tüm malzemeler embriyo kültür notu ve Sigma-Aldrich. 4 0.22μm PVDF filtreleri (biz Milipore Stericups) ve mağaza ° C ile sterilize Filtre
iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" Tablo 2 "/>
Tablo 2. CZB orta Tarif. Tüm malzemeler embriyo kültür notu ve Sigma-Aldrich. 4 0.22μm PVDF filtreleri (biz Milipore Stericups) ve mağaza ° C ile sterilize Filtre
Discussion
Mikroenjeksiyon oositlerin mayotik olgunlaşma 10,11, 12, 13 düzenleyen mekanizmalar çalışmak için güçlü bir yöntemdir . Bu yöntem ve hedefli transgenik fare modelleri, gelişmekte olan büyük bir yatırım yapmadan önce, hipotezleri test etmek için ekonomik bir yol sağlar. Oosit toplama ve mikroenjeksiyon teknikleri tipik hücre biyolojisi prosedürleri daha master için daha fazla zaman gerektirir. Koleksiyonu ile Özel engeller genellikle koleksiyonu için uygun büyüklükte cam pipet çekerek ve somatik hücre sıyırma ve oosit inkübatör dışında olduğu zaman en aza indirmek için toplama hızını artırarak, ağız pipet kontrol içerir. Biz deneyler yapmak için önce pek çok kez pratik tavsiye ederiz. Aynı sayıda hücre korurken microdrops arasında oosit aktarma, bu yöntem ile rahat olmak için harika bir yoldur.
Mikroenjeksiyon öğrenme sırasında hücre ölümü görülür. Bu enjeksiyon iğne ile oosit karşı tarafında piercing çekirdeği isabet nedenlerle çok büyük bir malzeme hacmi (yani bir iğne açılması çok büyük) enjeksiyonu da dahil olmak üzere bir dizi,, ya da meydana gelebilir enjekte edilen malzeme oosit için zehirlidir. Hayatta kalma oranı en az% 50 kadar oosit içine enjekte tampon Uygulama mastering bu tekniğin önemli. Oosit olgunlaşması için başarısız olursa milrinon yeterince seyreltilmiş olmadığını muhtemeldir. Biz olgunlaşma önce milrinon ücretsiz CZB çok büyük damlalar yoluyla oosit durulama önerilir.
Ploidi analizi aşağıdaki mikroenjeksiyon mayotik olgunlaşma değerlendirmek için birçok testlerinin biridir. Laboratuvarda kullanan diğer rutin analizler kinetiği izleme mili oluşumu ve kromozom uyum ve yumurta aktivasyonu analiz ya da in vitro fertilizasyon oosit manipülasyon 14,15 gelişimsel sonuçları, 16 değerlendirmek için immünofloresan mayoz yoluyla oosit ilerleme, 17.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Richard M. Schultz 'un laboratuvarında gerçekleştirildi. Yazarlar ayrıca sentromer sayma tahlil ve onun konfokal mikroskop erişim kavramsallaştırma Michael Lampson kabul etmek istiyorum. Teresa Çan ve Francesca Duncan sentromer sayma tahlil optimize etmede yardımcı oldu. Paula Stein HD022681 tarafından desteklenen (RMS) ve Karen Schindler HD055822 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents: | |||
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
| CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
| Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
| Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Table of specific equipment: | |||
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
| 60 mm Petri Dish | Falcon BD | 351007 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Side warmer | Fisher Scientific | Any standard model | |
| Dissection microscope | Any standard model | ||
| Chamber Slide | Nalge Nunc international | 177372 | |
| Capillary Tubing | Drummond Scientific | 1-000-0500 | microcaps |
| Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Any standard model | |
| Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
| Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
| CO2 tanks | For incubator | ||
| N2 tank | For table and injector | ||
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp. | Any standard model | |
| Incubator | Any standard model | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | Any standard model | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | Any standard model | |
| Humidified chamber | We use tupperware | ||
| Lid of 96 well plate | Nalge Nunc international | 263339 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
| Center well organ culture dish | Fisher Scientific | 353037 | 60 X 15mm |
References
- Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).
- Schultz, M. R. Oogenesis and the control of meiotic maturation. , Cambridge University Press. New York. (1986).
- Moore, G. P., Lintern-Moore, S. Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).
- Hodges, C. A., Hunt, P. A. Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).
- Schindler, K., Schultz, R. M. Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. 20 (17), 1522-1522 (2010).
- Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. Science. 286 (5441), 971-971 (1999).
- Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).
- Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).
- Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Cell. 130 (4), 484-484 (2007).
- Backs, J., Stein, P., Backs, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).
- Schindler, K., Schultz, R. M. Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).
- Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. Cell. 126 (1), 135-135 (2006).
- Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).
