הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Summary

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

Abstract

טעויות הפרדה כרומוזום להוביל תאים aneuploid. בתאים סומטיים, aneuploidy קשורה לסרטן אך הגמטות, aneuploidy מוביל, הפלות פוריות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. הגמטות הפלואידים טופס באמצעות מינים ספציפיים תוכניות התפתחותיות, כי הם מצמידים את המיוזה. החלוקה meiotic הראשון (MI) היא ייחודית כי המיוזה chromatids אחותה להישאר מחובר בזמן כרומוזומים הומולוגיים הם נפרדים. מסיבות לא מובנות לגמרי, חלוקה זו reductional נוטה שגיאות הוא הנפוץ יותר את מקור aneuploidy מאשר טעויות מיוזה II (MII) או יותר טעויות ^1,2 המיוזה זכר.

אצל יונקים, ביציות מעצר בבית prophase אמ"ן עם שלפוחית ​​גדולה נבטי שלם (GV; הגרעין) ורק קורות חיים המיוזה כאשר הם מקבלים רמזים הביוץ. לאחר המיוזה קורות חיים, ביציות MI שלם לעבור חלוקת התא סימטרית, לעצור שוב metaphase של MII. ביצים לא להשלים MII עד שהם מופרית על ידי הזרע. ביציות גם יכול לעבור התבגרות meiotic באמצעות הוקמה בשנת תנאים במבחנה תרבות ^3. בגלל דור של מוטנטים עכבר מהונדס גנטי ו במיקוד יקר יכול לקחת פרקי זמן ארוכים, מניפולציה של גמטות נשים במבחנה היא אסטרטגיה חסכוני יותר חוסך זמן.

כאן אנו מתארים שיטות לבודד prophase, נעצר ביציות מעכברים עבור microinjection. כל חומר הבחירה עשויה להיות מוחדר הביצית, אלא בגלל meiotically-המוסמכת ביציות שותקות transcriptionally Crna ^4,5, ולא דנ"א, חייב להיות מוזרק ללימודי ביטוי חוץ רחמי. כדי להעריך ploidy, אנו מתארים התנאים שלנו ב ההבשלה חוץ גופית של ביציות לביצים MII. מבחינה היסטורית, כרומוזום הפצת טכניקות המשמשות ספירת כרומוזום מספר ^6. שיטה זו מאתגרת מבחינה טכנית מוגבלת רק לזיהוי hyperploidies. כאן אנו מתארים שיטה כדי לקבוע תת ו hyperploidies באמצעות ביצים שלמות ^7-8. שיטה זו משתמשת monastrol, מעכב kinesin-5, אשר קורסת ציר דו קוטבית לתוך ציר monopolar ⁹ כרומוזומים ובכך להפריד כזה kinetochores אדם יכול בקלות להיות מזוהה וספר באמצעות נסיוב אנטי CREST אוטואימוניות. בגלל שיטה זו מבוצעת ביצים שלמות, הכרומוזומים לא הולכים לאיבוד בשל טעות של המפעיל.

Protocol

1. הביצית עכבר אוסף

1. כדי למקסם את מספר הזקיקים antral מבודד כל עכבר, intraperitoneally להזריק נקבות עכברים בוגרים מינית (אנו משתמשים 6 שבועות בן CF-1 עכברים מן הארלן) עם 5 IU של נסיוב סוסה בהריון של גונדוטרופין (PMSG).
2. הכן את אוסף בינוני (ממ / PVP) (3 מ"ל / עכבר) על ידי הוספת milrinone עד 2.5 מיקרומטר וחם אותו 37 ° C. Milrinone הוא מעכב phosphodiesterase המקיימת מעצר meiotic פעם ביציות יוסרו זקיקים. לחילופין, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (0.2 מ"מ) או dibutyryl-monophosphate מחזורי אדנוזין (dbcAMP) (100 מיקרוגרם / מ"ל) יכול לשמש. הכן את המדיום התרבות ידי הוספת גלוטמין (1 מ"מ) milrinone (2.5 מיקרומטר) ל 1 מ"ל של CZB ולאפשר לו לאזן בחממה במשך שעה לפחות. הגדרת microdrops של כל צלחת פטרי עם שכבת שמן מינרלי. המנה CZB מושם לתוך החממה בעוד צלחת ממ / PVP נשאר בחוץ בשקופית חם. אוסף אחרים בינוני תרבות כי הם זמינים מסחרית (M2 ו M16 מן התקשורת מיוחדים או סיגמא) גם בשימוש שגרתי.
3. כ 48 שעות לאחר PMSG תחול, להקריב את העכבר באמצעות CO ₂ הרגעה בעקבות נקע בצוואר הרחם, השחלות לנתח ולהכניס אותם לתוך watchglass המכיל מראש חימם ממ / PVP + milrinone (ממ / PVP + M).
4. באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל, לעגן את השחלות כדי בצלחת ולשחרר את זקיקי antral על ידי ניקוב אותם מספר פעמים עם מד-27 (או תפירה) מחטים כי הם מהודקים יחד.
5. בעוד להביט דרך מיקרוסקופ לנתיחה, לאסוף קומולוס-הביצית מתחמי באמצעות הפה המופעלים פיפטה מזכוכית. זה עוזר לי מיקרוסקופ עם הרבה ניגודיות. לחלופין, המדיום המכיל את רקמות תאים ניתן pipetted על מכסה של צלחת פטרי מפלסטיק. רק לאסוף גדול, זקיקי antral ולא קטן מראש antral זקיקים או ביציות הערומים. אסף פעם, כדי להעביר את מתחמי microdrop של ממ / PVP + M זה בשקופית חם תחת שמן.
6. בעזרת פיפטה קטנה (מעט גדול יותר מאשר קוטר של הביצית), פיפטה במעלה ובמורד מתחמי לנתק את התאים קומולוס. מעבירים את ביציות הערומים עם טפטפת לתוך microdrop גדול של CZB + milrinone (CZB + M) ומקום בחממה.
7. אפשר ביציות להתאושש במשך שעות לפחות 1 בחממה לפני מניפולציה.

2. הביצית microinjection

1. הפוך את pipettes הזרקת ידי משיכת בורוסיליקט זכוכית צינור נימי ב חולץ מכני. אנו משתמשים Flaming-micropipette חולץ בראון (דגם P-97) עם ההגדרות הבאות: P = 500, חום = 300, משוך = 150, לוול ךיב = 100, זמן = 150.
2. הכינו את הפלטפורמה microinjection ידי הצבת ירידה של 5 μl ממ / PVP + M קרוב ככל האפשר לירידה 0.5 μl של חומר הזרקה של בחירה (למשל siRNA, קרנה, oligonucleotide morpholino, וכו ') בשקופית 1-גם תא זה יש את תא התקשורת יוסרו. מכסים עם שמן מינרלי מקום על הבמה מיקרוסקופ (איור 1).
3. מקום ההזרקה pipettes מחזיק לתוך מחזיקי ואת המיקום לתוך ירידה של ממ / PVP + M. הפעל את הטנקים חנקן המחוברים picoinjector ואנטי רטט השולחן. פתח את קצה פיפטה את הזריקה בעדינות על ידי הקשה עליו מפני פיפטה מחזיקה בעוד ממלא אותו בינוני. אם הפתח גדול מדי, המדיום יעברו פנימה והחוצה במהירות המחט יהרוג את התא. Pipettes עם קטן מדי של פתיחת לעתים קרובות להדביק בקלות.
4. העברת ביציות (10/05) מן החממה עד טיפת ממ / PVP M + על הרציף. לפני הזרקה, ההתקנה picoinjector. אנו משתמשים בפרמטרים הבאים על picoinjector שלנו (דגם PLI-100 מהרווארד Apparatus): PBal = 2.5-3.5 psi, PInj = 7.8 psi, PClear = 10-12 psi, זמן = -3. התוצאה היא נפח זריקה של PL 5-10.
5. בעוד לחיצה שקוף, להעביר את המזרק עד טיפת חומר מילוי. להחזיר אותו טיפה הבינוני.
6. השתמש פיפטה מחזיקה ללכוד הביצית וליישר את מחט הזריקה, הביצית ו פיפטה מחזיק לאורך ציר ה-x.
7. תחת הגדלה גבוהה, לקדם את פיפטה הזרקה באמצעות הביצית להיות זהיר, כדי למנוע את הגרעין. לאחר הממברנה הפלסמטית היא פירסינג, לחץ להזריק. לאחר ההזרקה, למשוך את המחט. שחרור הביצית וחזור. לאחר כל ביציות מוזרקים, להחזיר אותם בחממה. תחזיק ב CZB + M בסכום הרצוי של זמן; הפעם תלוי במטרה הניסוי (כלומר siRNA ו מציאה morpholino (עד 24 שעות), overexpression (3-12 שעות)). שים לב incubations יותר מ 24 שעות תתפשר התבגרות meiotic.

3. הביצית הבשלה

1. לאחר דגירה לשטוף את ביציות באמצעות מספר טיפות של CZB (בינוני התבגרות) והעברה microdrop של המדיום התבגרות תחת שמן מקום בחממה.
2. אפשר 16 שעות עבור t הבשלה מלאה o metaphase של המיוזה השנייה.

4. Ploidy ניתוח

1. הכן CZB + monastrol (100 מיקרומטר) ומקום 750 μl לתוך הבאר של צלחת איבר תרבות כי יש מים בטבעת החיצונית.
2. לשטוף ביצים באמצעות מספר טיפות של CZB + monastrol ולהעביר אותם לתוך צלחת התרבית איברים. מקום בחממה עבור ח 1
3. תקן את הביצים על ידי העברת אותם watchglass המכיל paraformaldehyde 2% PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העברת לתוך watchglass אחר עם חסימת פתרון. מנה זו ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס עד מעובד.
4. העברה פתרון permeabilization (PBS + 0.3% + BSA TritonX-100 0.1% + 0.02% NaN ₃₎ ב watchglass במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף באמצעות כמויות גדולות של מספר חסימת פתרון (PBS + 0.3% + 0.01 BSA Tween-20 + NaN 0.02% _3).
5. שאר ההליך מבוצע על מכסה של צלחת 96-היטב בתא humidified בטמפרטורת החדר המוגן מן האור. טיפות (~ 25 μl) ממוקמים בתוך החריצים מעגלית. העברת ביצים לחסימת פתרון במשך 15 דקות.
6. כדי תווית centromeres, ביצים להעביר ירידה של פתרון חסימת המכיל CREST אנטי סרום בשעה 01:40. דגירה של לפחות 1 ח לשטוף באמצעות 3 טיפות של תמיסת חסימה, דוגרים 15 דקות כל אחד.
7. העברת ביצים ירידה של פתרון חסימת המכיל Cy5 או Alexa-פלואוריד-594-מצומדות אנטי אנושי IgG (1:200) ו דגירה עבור 1h. חזור על הצעדים לעיל כביסה למעט השלב האחרון, כולל Sytox הירוק (1:5,000) בפתרון חסימת לזהות כרומוזומים. הר ב μl 5 של Vectashield. כדי למנוע ריסוק של הביצים, לשים 4 נקודות קטנה של וזלין בפינות היכן coverslip יהיה. מניחים coverslip על גבי חותמת עם לק. חנות בתוך קופסת שקופיות על 4 מעלות צלזיוס עד עיבוד באמצעות מיקרוסקופיה confocal.
8. בעוד הדמיה עם מטרה 100x, ללכוד 0.4 מיקרומטר צעדים במישור-Z ואת התמונה של האזור כולו ציר metaphase. הרוזן centromeres באמצעות תוכנת הדמיה כגון תמונה J (NIH).

5. נציג תוצאות:

איור 2 הוא השלכה Z-מביצית euploid. בשלב metaphase של MII, ביצים euploid עכבר מכילים 20 זוגות של כרומוזומים, ולכן יש 40 centromeres. מדי פעם הכרומוזומים להיכשל להפיץ למרות הטיפול monastrol. מצב זה מקשה על ספירת centromeres אמין ולכן אנו לא כוללים את הביצים הניתוחים שלנו. מדי פעם, יכול להיות אתגר כדי לקבוע אם CREST-immunoreactive "כתם" היא 1 או 2 centromeres. שימוש בתוכניות כגון J תמונה שימושית כי אפשר לנתח כל Z-סעיף תוך הקפדה לציין את הכיוון של כרומוזומים, מספר סעיפים בו "כתם" היא לאתר את עוצמת הפיקסל "נקודות" יש. בהתאם שבו ציר meiotic ממוקם ביחס לגוף קוטב, אזורים של DNA יכולים לחפוף אלה דגימות לא צריך להיכלל בניתוח.

Unmanipulated, בביצים הביוץ vivo מעכברים reproductively צעירים יש שיעור נמוך של aneuploidy (~ 1-2%). עם זאת, מסיבות לא מובנות, microinjection ובשיטות חוץ גופית ההתבגרות יכולים להגדיל את זה כלפי מעלה בשיעור של 10%. לכן, זה קריטי, כי ביציות לשלוט מוזרק כלולים בכל מחקר microinjection.

באיור 1. צלחת Microinjection להגדיר. שקופית קאמרית עם 5 טיפות של μl ממ / PVP + M מעל 0.5μl טיפות של תמיסת ההזרקה. מכסים עם שמן מינרלי. בדוגמה זו יש 3 טיפות 3 פתרונות הזרקה שונים והחלק את יושב על הבמה של מיקרוסקופ. משמאל את המחט microinjection וימינה הוא פיפטה מחזיקה. שים לב שיש השתקפות של מחזיקי מחט.

איור 2. Ploidy התוצאות. Z-השלכה של ביצה euploid II metaphase. DNA הוא בצבע ירוק kinetochores נצבעים באדום. החיצים מצביעים על 2 זרועות chromatid ברורים המעידים כי kinetochores (# 17 ו # 18) חופפים. ביצים עכבר Euploid מכילים 20 זוגות kinetochore (40 בסך הכל "נקודות"). ביצה aneuploid היה להכיל כל וריאציה על המספר הזה. אם הליך זה נערכו על ביציות metaphase MI, יהיו 40 זוגות kinetochore (80 בסך הכל "נקודות").

טבלה 1. מתכון בינוני איסוף microinjection (ממ / PVP + M). כל החומרים העובר תרבות כיתה ו מבית סיגמא אולדריץ. סנן לעקר דרך 0.22μm מסננים PVDF (אנו משתמשים Stericups Milipore) ולאחסן ב 4 ° C.

iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" טבלה 2 "/>
טבלה 2. מתכון בינוני CZB. כל החומרים העובר תרבות כיתה ו מבית סיגמא אולדריץ. סנן לעקר דרך 0.22μm מסננים PVDF (אנו משתמשים Stericups Milipore) ולאחסן ב 4 ° C.

Discussion

Microinjection של ביציות היא שיטה חזקה ללמוד המנגנונים המווסתים התבגרות meiotic ^{10,11, 12, 13.} שיטה זו מספקת דרך חסכונית לבחון השערות לפני ביצוע ההשקעה הגדולה בפיתוח מודלים עכבר מהונדס ממוקד. אוסף הביצית וטכניקות microinjection דורשים זמן רב יותר מאשר הורים נהלים ביולוגיה אופייני התא. מכשולים ספציפיים עם אוסף לעיתים קרובות כוללים שליטה על פיפטה בפה, מושך את פיפטה זכוכית בגודל מתאים לאיסוף הפשטה של ​​תאים סומטיים והגדלת מהירות אוסף כדי לצמצם את הזמן שבו ביציות הן מחוץ לחממה. מומלץ לתרגל פעמים רבות לפני ביצוע הניסויים. העברת ביציות בין microdrops תוך שמירה על אותו מספר של תאים היא דרך מצוינת להיות נוח עם שיטה זו.

מוות של תאים נפוצה בזמן למידה microinjection. זה יכול לקרות מכמה סיבות, כולל הזרקת גדול מדי של אמצעי אחסון של חומר (כלומר פתיחת מחט הזרקה גדול מדי), להכות את הגרעין עם מחט הזריקה, פירסינג הצד הנגדי של הביצית או שהחומר המוזרק רעיל הביצית. תרגול עם הזרקה לתוך ביציות חיץ עד שיעור ההישרדות שלך היא לפחות 50% היא המפתח שליטה בטכניקה זו. אם ביציות אינם בשלים סביר להניח כי milrinone לא מדולל מספיק. אנו ממליצים על שטיפת ביציות באמצעות טיפות גדולות רבות CZB milrinone חופשי לפני ההבשלה.

Microinjection ploidy בעקבות הניתוח היא אחת מבחני רבים להעריך התבגרות meiotic. ניתוח שגרתי אחר אנו משתמשים במעבדה כוללים מעקב אחר קינטיקה שבאמצעותו התקדמות ביציות דרך המיוזה, immunofluorescence לנתח את היווצרות ציר ויישור כרומוזום והפעלה ביצה או הפריה חוץ גופית על מנת להעריך את ההשלכות התפתחותיות של מניפולציה הביצית ^{14,15, 16, 17.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents:
Milrinone	Sigma-Aldrich	M4659	Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5310	Only use embryo-tested, sterile-filtered
CREST autoserum	Immunovision	HCT-0100
Sytox Green	Invitrogen	57020
Anti-human Alexa 594	Invitrogen	A-11014
Vectashield	Vector Laboratories	H-100
Paraformaldehyde	Polysciences, Inc.	577773
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A3294
PMSG	Calbiochem	367222
Monastrol	Sigma-Aldrich	M8515	Resuspend in DMSO at 100mM
Tween-20	Sigma-Aldrich	274348
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X-100
Table of specific equipment:
Mouthpiece	Biodiseno	MP-001-Y
Watchglass	Electron Microscopy Sciences	70543-30
Syringe	BD Biosciences	309623	1ml, 27G1/2
60 mm Petri Dish	Falcon BD	351007
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-200
Side warmer	Fisher Scientific		Any standard model
Dissection microscope			Any standard model
Chamber Slide	Nalge Nunc international	177372
Capillary Tubing	Drummond Scientific	1-000-0500	microcaps
Pipette Puller	Flaming-Brown micropipette puller		Model P-97
Inverted microscope	Nikon Instruments		Any standard model
Micromanipulators	Eppendorf		Any standard model
Picoinjector	Harvard Apparatus	Model PLI-100	Any standard model
CO2 tanks			For incubator
N2 tank			For table and injector
Anti-vibration table	Technical Manufacturing Corp.		Any standard model
Incubator			Any standard model
Holding pipettes	Eppendorf	930001015	Vacutip
Confocal microscope	Leica Microsystems		Any standard model
Dissection tools	Fine Science Tools		Any standard model
Humidified chamber			We use tupperware
Lid of 96 well plate	Nalge Nunc international	263339
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-3
Coverslips	Thomas Scientific	6663-F10	Thickness will vary for particular microscopes
Center well organ culture dish	Fisher Scientific	353037	60 X 15mm