卵母細胞が減数分裂成熟中に染色体の分離の誤差による異数性になりやすいです。異数体卵は不妊、流産やダウン症などの発達障害を引き起こす可能性があります。ここでは、卵母細胞と減数分裂成熟を研究し、倍数性を評価する方法に選択の材料を導入する方法を説明します。
染色体の分離に間違いが異数体細胞につながる。体細胞では、異数性が癌に関連付けられていますが配偶子には、異数性は、ダウン症候群のように不妊、流産や発育障害につながります。半数体の配偶子は減数分裂に結合されている種特異的な発生プログラムを介して形成されます。姉妹染色分体が相同染色体が分離されている間、接続されたままため、最初の減数分裂(MI)は、減数分裂に特有です。理由はよく分からないのですが、このreductional部門では、エラーを起こしやすいですし、より一般的に減数分裂II(MII)の誤差よりまたは男性の減数分裂の1,2の誤差よりも異数性の源です。
哺乳類では、大規模な、無傷の卵核胞(GV;核)とMIの前期における卵母細胞の逮捕と彼らは排卵の合図を受け取るときだけ減数分裂を再開する。一度減数分裂の再開、卵母細胞の完全なMIとMIIの中期で再び逮捕、非対称細胞分裂を受ける。彼らは精子によって受精されるまで卵はMIIを完了しません。卵母細胞はまた 、in vitro の培養条件3 に確立された使用して減数分裂成熟することができます。トランスジェニックおよび遺伝子標的マウスの変異体の生成はコストがかかると、長時間かかることがあるため、in vitroでの女性の配偶子の操作は、より経済的と時間の節約の戦略です。
ここで、我々は、マウスからとマイクロインジェクション用の前期、逮捕された卵母細胞を分離する方法を説明します。任意に選択した材料は、卵母細胞に導入することができるが、減数分裂、有能な卵母細胞は4,5 cRNAのではなく、DNA転写サイレントなので、異所性発現の研究のために注入されている必要があります。倍数性を評価するために、我々は、MIIの卵に卵母細胞の体外成熟のために私達の条件を説明します。歴史的に、染色体拡散技術は、染色体数6をカウントするために使用されています。このメソッドは、技術的に困難であるとだけhyperploidiesを識別するために制限されています。ここで、我々は、低刺激、7-8無傷の卵を使用してhyperploidiesを決定する方法を説明します。このメソッドは、monastrol、したがって個々の動原体は容易に抗CREST免疫血清を用いて検出してカウントすることができるように染色体を分離するモノポーラスピンドル9にバイポーラスピンドルを折りたたみますキネシン- 5阻害剤を、使用しています。このメソッドはそのまま卵で実行されるため、染色体は、オペレータのエラーのために失われていません。
卵母細胞のマイクロインジェクションは、減数分裂成熟10,11、12、13を制御するメカニズムを研究する強力な方法です。このメソッドは、トランスジェニックおよびターゲットマウスモデルの開発に大きな投資を行う前に仮説をテストするための経済的な方法を提供します。卵母細胞の収集とマイクロインジェクション技術は、典型的な細胞生物学の手続きよりもマスターに多くの時間を必要とする。コレクションを持つ特定の障害は、しばしば収集のために適切なサイズのガラスピペットを引くと体細胞の剥離や卵母細胞は、インキュベーターの外である時間を最小限にするためにコレクションの速度を上げ、口のピペットを制御含まれています。我々は実験を実行する前に何度も練習をお勧めします。セルの同じ数を維持しながらmicrodropsの間に卵母細胞を転送すると、この方法に慣れるのに最適な方法です。
マイクロインジェクションを学習しながら細胞死がよく発生します。これは、卵母細胞の反対側にピアス、注射針で核を打つ、材料の体積が大きすぎるの注入(注射針の開口部が大きすぎる、すなわち)を含むいくつかの理由で発生しますか材料が注入されたことができる卵母細胞に対して毒性が強い。あなたの生存率は少なくとも50%になるまで卵母細胞にバッファーを注入して練習すると、このテクニックをマスターする鍵となります。卵母細胞の成熟に失敗した場合には、ミルリノンが十分に希釈されていない可能性があります。我々は、成熟前にミルリノンフリーCZBの多くの大滴を通して卵母細胞を洗浄することをお勧めします。
倍数性分析は、次のマイクロインジェクションは、減数分裂成熟を評価するために多くのアッセイの一つです。我々は実験室で使用する他のルーチン分析には、減数分裂、卵母細胞の操作14,15の発達の影響を評価するための紡錘体形成および染色体の整列と卵の活性化を分析するための免疫蛍光や体外受精、16を通ってから卵母細胞の進行速度を監視して含まれています17。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、リチャードM.シュルツの研究室で実施された。また、作者はセントロメア計数アッセイと彼の共焦点顕微鏡へのアクセスを概念化するためのマイケルランプソンに感謝します。テレサチェンとフランチェスカダンカンは、セントロメア計数アッセイの最適化に協力した。ポーラスタインは、HD022681でサポートされています(RMSまで)とカレンシンドラーはHD055822でサポートされています。
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |